周宇科，付詩鳴，任汐月，鄭吳偉，祁勇剛，胡 勇

（湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院 湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心，湖北 武漢 430068）

蝦殼是小龍蝦加工過程中的副產(chǎn)物，約占小龍蝦質量的33%，不但造成生物資源浪費嚴重，而且會對環(huán)境造成污染[1-2]。蝦青素廣泛存在于蝦、蟹等水產(chǎn)品中，具有抗衰老、抗腫瘤、預防心腦血管疾病和抗糖尿病等多種生理功能[3-4]。蝦青素常見的提取方法包括堿提法、酶解法和有機溶劑浸提法等，但通常都有提取效果較低、有機溶劑殘留和成本昂貴等問題[5-6]。張莉莉等[7]使用膦基鹽離子液體替代咪唑基離子液體，以卵磷脂替代親水性表面活性劑構筑一種新型微乳液體系，采用超聲輔助從南極磷蝦殼中提取蝦青素，蝦青素提取率可達97.75%，提取量為（48.21±0.07）μg/g。羅建光[8]采用超臨界CO2法從小龍蝦中提取蝦青素，最佳的提取溫度為40 ℃，最佳的夾帶劑為1倍劑量的體積分數(shù)95%的乙醇，CO2流量為30 L/h，最佳的提取壓力為30 MPa，提取溫度為50 ℃，分離溫度為40 ℃，物料粒徑為0.425 mm，蝦青素產(chǎn)率最高，可達26.13 μg/g。SACHINDRA N M等[9-10]使用有機混合溶劑（異丙醇∶己烷=1∶1，V/V）從蝦殼廢料中提取蝦青素的產(chǎn)率最高。然而，丙酮等有機溶劑具有易揮發(fā)、致毒的缺點，在食品加工過程中可能存在試劑殘留，危害生產(chǎn)人員健康等安全隱患。

食醋中含有豐富的營養(yǎng)成分，除乙酸外，還含有其他有機酸類、醇類、酯類、酮類和醛類物質[11-12]，可以作為有機溶劑溶解蝦殼中的蝦青素[5]。液態(tài)發(fā)酵食醋具有自動化程度高、原料利用率高、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品質量穩(wěn)定的優(yōu)勢，將蝦殼作為原料之一用于液態(tài)食醋釀造，既避免資源浪費，又能制備出富含蝦青素的功能性食醋[13-14]。

本研究在米醋釀制的不同階段添加蝦殼，考察在不同發(fā)酵階段添加蝦殼對米醋（本文簡稱蝦殼米醋）風味和抗氧化活性的影響，以期為工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素及蝦青素產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮小龍蝦蝦殼（本文簡稱蝦殼）：由德炎水產(chǎn)食品股份有限公司提供；高活性干酵母：安琪酵母有限公司。

大米：市售；巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）AS1.41：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；黑曲霉（Aspergillus niger）：湖北工業(yè)大學食品發(fā)酵工程技術研究室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

醋酸菌液體培養(yǎng)基[1]：20 g/L葡萄糖，20 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨。

黑曲霉液體培養(yǎng)基[1]：5 g/L蛋白胨，10 g/L葡萄糖，1 g/L KH2PO4，0.5 g/L Mg2SO4，0.033 g/L孟加拉紅，0.1 g/L氯霉素。

以上培養(yǎng)基均于115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑

酵母提取物、葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、Mg2SO4、氫氧化鈉、福林酚、沒食子酸、鹽酸等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；孟加拉紅：福州飛凈生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；耐高溫α-淀粉酶（4 000 U/g）、糖化酶（10萬U/g）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）儀、Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）、Agilent HP-5MS色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）：安捷倫科技（中國）有限公司；ZHH-Z1214型超凈工作臺：上海智城分析儀器有限公司；YXQ-SG41-280-B型高壓蒸汽滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠；AR323CN型電子天平：奧豪斯儀器有限公司；WFJ2000型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器設備有限公司；ZHWY2102C型恒溫振蕩培養(yǎng)器：上海智城儀器廠；安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦殼米醋的工藝流程及操作要點

蝦殼米醋的釀制工藝流程參考楊馨悅等[15]的方法并稍作改進。

操作要點：

大米糊化：大米粉碎至通過80目篩，去除結塊后，將大米粉緩緩加入水中，攪拌，煮至淀粉完全糊化。

液化：加入0.5%的耐高溫α-淀粉酶，攪拌均勻后，在95 ℃條件下酶解2 h。

糖化：溫度降至62 ℃后，加入0.7%的糖化酶，然后將料液轉移至恒溫培養(yǎng)箱中，45 ℃酶解6 h。

高活性干酵母活化：在35～38 ℃無菌蒸餾水中加入10%干酵母和0.2%白砂糖，充分攪拌，確保酵母完全溶解，蓋上保鮮膜在35～38 ℃條件下水浴活化20～30 min。

酒精發(fā)酵：高活性干酵母活化后，按料液的3‰比例接種到糖化液中，同時添加2%黑曲霉細胞裂解液，混勻后置于38 ℃的恒溫培養(yǎng)箱進行酒精發(fā)酵。釀酒酵母無氧發(fā)酵期間會不斷產(chǎn)生氣泡，因此每隔一段時間需排出瓶中的氣體，當料液變澄清，不再有氣泡冒出且酒精度不再上升時，即酒精發(fā)酵完成。

醋酸菌活化：巴氏醋酸桿菌AS1.41接種于醋酸菌液體培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)至OD600nm值＞0.8。

醋酸發(fā)酵：醋酸菌活化后接種到發(fā)酵液中，置于培養(yǎng)箱中34 ℃、180 r/min醋酸發(fā)酵。當酸度不再增加或緩慢增加時，即醋酸發(fā)酵完成。

過濾：醋酸發(fā)酵完成后使用濾布對醋液進行粗濾得到米醋。

蝦殼米醋制備：分別在大米糊化（樣品1）、糖化（樣品2）、酒精發(fā)酵（樣品3）、醋酸發(fā)酵（樣品4）階段按蝦殼∶大米=1∶4（V/V）添加蝦殼，在醋酸發(fā)酵結束后的米醋（樣品6）按蝦殼∶大米=1∶4（V/V）添加蝦殼28 ℃浸泡6 h（樣品5）制備蝦殼米醋。

1.3.2 理化指標的測定方法

蝦青素測定方法：參考文獻[16-17]的方法并修改，取1 mL冷凍干燥后的醋樣使用流動相復溶，離心后用0.22 μm的有機系微孔濾膜過濾。

色譜條件：Kromasil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，流動相為乙腈；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL，檢測波長475 nm，柱溫25 ℃。

標準曲線的繪制：稱取蝦青素標準品10.3 mg置入燒杯中，使用乙腈溶解配制成質量濃度為100 μg/mL的蝦青素標準溶液，并將其分別稀釋至1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL，使用高效液相色譜儀進行檢測，得到峰面積（y）與蝦青素質量濃度（x）之間的標準曲線回歸方程：y=0.195 2x-0.283（相關系數(shù)R2=0.999 8）。

總多酚、總黃酮含量：參考翟淑紅等[18]的方法測定；DPPH自由基清除能力：參考李詩穎等[19]的方法測定；羥基自由基清除能力：參考王征帆等[20]的方法測定。

1.3.3 揮發(fā)性風味物質測定

參考王超等[21]的方法測定樣品中的揮發(fā)性風味成分。

1.3.4 感官評定

隨機抽取10名評分員（5男5女）組成感官評定小組，對米醋的口感、香氣、形態(tài)、色澤按照GB 18187—2000《釀造食醋》進行評價和描述，評定標準見表1[22]，取10人的平均分，滿分為100分。進一步按照參考文獻[23]提出的篩選方法評定食醋滋味，以下5種水溶液作為“滋味”標準：甜味（蔗糖35 g/L）、鮮味（谷氨酸鈉0.6 g/L）、咸味（氯化鈉2 g/L）、酸味（乳酸1.65 g/L）、苦味（L-異亮氨酸5 g/L）。

表1 蝦殼米醋感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of crayfish shell rice vinegar

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段添加蝦殼對蝦殼米醋中蝦青素含量的影響

不同發(fā)酵階段添加蝦殼對蝦殼米醋中蝦青素含量的影響見圖1。由圖1可知，在大米糊化過程中添加蝦殼（樣品1）的蝦殼米醋中蝦青素含量最高，為0.315 mg/L，顯著高于在醋酸發(fā)酵過程添加蝦殼（樣品4）和米醋浸泡蝦殼過程（樣品5）（P＜0.05）；高于糖化過程添加蝦殼（樣品2）和酒精發(fā)酵過程中添加蝦殼（樣品3），但不顯著（P＞0.05）。結果表明，在米醋發(fā)酵的大米糊化階段添加蝦殼對蝦殼中蝦青素的提取效果最好。

圖1 不同發(fā)酵階段添加蝦殼對蝦殼米醋蝦青素含量的影響Fig.1 Effects of crayfish shell addition at different fermentation stages on astaxanthin content of crayfish shell rice vinegar

2.2 不同發(fā)酵階段添加蝦殼對蝦殼米醋中總多酚、總黃酮含量的影響

不同發(fā)酵階段添加蝦殼對蝦殼米醋的總多酚、總黃酮含量的影響見圖2。由圖2可知，在米醋不同發(fā)酵階段添加蝦殼，蝦殼米醋的總多酚含量呈下降趨勢，而總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，但與沒有添加蝦殼的米醋相比均有顯著性提高（P＜0.05），總多酚含量提高了90.21%～219.09%，總黃酮含量提高了34.09%～102.83%；其中，在糊化階段添加蝦殼所制備的蝦殼米醋中（樣品1）總多酚含量最高，在糖化發(fā)酵階段添加蝦殼制備的蝦殼米醋（樣品2）總黃酮含量最高，分別為81.78 mg/L和25.05 mg/L。

圖2 不同發(fā)酵階段添加蝦殼對蝦殼米醋總多酚及總黃酮含量的影響Fig.2 Effects of crayfish shell addition at different fermentation stages on the contents of total polyphenols and total flavonoids of crayfish shell rice vinegar

2.3 不同發(fā)酵階段添加蝦殼對蝦殼米醋DPPH、羥基自由基清除率的影響

不同發(fā)酵階段添加蝦殼對蝦殼米醋DPPH、羥基自由基清除率的影響見圖3。由圖3可知，在米醋不同發(fā)酵階段添加蝦殼后，蝦殼米醋DPPH、羥基自由基清除能力與空白米醋相比均有顯著性提高（P＜0.05），其中在糊化階段添加蝦殼所制備的蝦殼米醋（樣品1）DPPH清除率最高，為95.87%，比沒有添加蝦殼的米醋的DPPH自由基清除率（63.76%）高32.11%。在糖化發(fā)酵階段添加蝦殼制備的蝦殼米醋（樣品2）羥基自由基清除率最高，為66.35%，比沒有添加蝦殼制備的米醋羥基自由基清除率（52.85%）高13.50%。

圖3 不同發(fā)酵階段添加蝦殼對蝦殼米醋DPPH及羥基自由基清除率的影響Fig.3 Effects of crayfish shell addition at different fermentation stages on DPPH and hydroxyl radical scavenging rate of crayfish shell rice vinegar

2.4 不同發(fā)酵階段添加蝦殼米醋揮發(fā)性成分分析

由表2可知，6種米醋中共檢測出揮發(fā)性香氣成分32種，其中酸類6種、醇類2種、酯類15種、醛酮類7種、其他物質2種。醇類揮發(fā)性物質含量占比最高，其次是酯類，酸類和醛酮類揮發(fā)性物質含量占比較低。酸類物質中樣品1含量最高（18.56 mg/L），樣品5含量最低（1.51 mg/L）；酯類物質中樣品1含量最高（46.09 mg/L），樣品4含量最低（13.25 mg/L）；醇類物質中樣品2的含量最高（153.75 mg/L），米醋含量最低（56.1 mg/L）；醛酮類物質中樣品2含量最高（15.35 mg/L），樣品3含量最低（6.64 mg/L）。辛酸稀釋后呈水果香氣[24]，在樣品2、樣品4和樣品3中的含量高于空白米醋、樣品5和樣品1，表明糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵階段添加蝦殼能夠促進辛酸的產(chǎn)生，而在糊化階段添加蝦殼和米醋浸泡蝦殼過程對辛酸的產(chǎn)生影響較小。己酸乙酯具有果香和酒香香氣[25-26]，在樣品1的含量高于米醋及其他樣品醋，表明在糊化階段，蝦殼的添加促進了己酸乙酯的產(chǎn)生，而在糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵階段和浸泡階段，蝦青素的產(chǎn)生抑制了微生物代謝[27]，導致己酸乙酯和癸酸乙酯產(chǎn)量減小。苯乙醇在添加蝦殼后的米醋中的含量均高于米醋，表明蝦殼的添加促進了苯乙醇和苯甲醛的生成。在添加了蝦殼后，增加了醋中的酸類風味物質和醇類風味物質的產(chǎn)生。在糊化、糖化階段添加蝦殼后能夠增加醋中酯類化合物的生成。

表2 不同發(fā)酵階段添加蝦殼對蝦殼米醋揮發(fā)性成分的影響Table 2 Effects of crayfish shell addition at different fermentation stages on volatile components of crayfish shell rice vinegar

2.5 不同發(fā)酵階段添加蝦殼的蝦殼米醋感官評價

不同發(fā)酵階段添加蝦殼的蝦殼米醋感官評價結果見圖4。

圖4 不同米醋樣品的感官評分（A）與滋味評價雷達圖（B）Fig.4 Sensory score (A) and taste evaluation radar diagram (B) of different rice vinegar samples

由圖4（A）可知，在大米糊化階段添加蝦殼釀制的樣品1感官評分最高，其次為糖化階段添加蝦殼釀制釀制的樣品2。由圖4（B）可知，空白米醋的醋酸氣味較濃，難以分辨食醋中其他香氣成分。食醋的滋味以酸味為主，甜味和鮮味次之，最后是溫和的咸味和苦味[28]。由于米醋中醋酸含量較高，導致其酸味刺激性較強，而添加蝦殼后的米醋中除醋酸外，其他有機酸含量較高，酸味較米醋更柔和，鮮味和甜味分值都高于米醋。米醋和樣品5的感官差異較小。

3 結論

在米醋釀制的不同階段添加蝦殼釀制米醋并研究了米醋的風味和功能性，觀察蝦殼的添加對食醋品質、風味和抗氧化活性的影響。

在不同發(fā)酵階段添加蝦殼對米醋的風味和抗氧化活性的影響具有一定的差異。從功能性方面來看，在發(fā)酵過程中添加蝦殼后，其抗氧化活性明顯高于空白米醋。其中，在大米糊化階段添加蝦殼釀造米醋，其總多酚（81.78 mg/L）、蝦青素含量（0.315 mg/L）以及DPPH自由基清除率（95.87%）均為最高。而用米醋浸泡蝦殼法釀制米醋，其總多酚（48.8mg/L）、總黃酮（17.3 mg/L）以及蝦青素含量（0.15 mg/L）、DPPH自由基清除率（83%）和羥基自由基清除率（52.8%）均最低。從風味方面來看，在添加蝦殼后，酸類和醇類風味物質含量較米醋相比顯著增加，其中在糊化階段添加蝦殼釀制的樣品1產(chǎn)生的酸類和酯類風味物質含量最多，分別為酸類18.56 mg/L，酯類46.09 mg/L，而在糖化階段添加蝦殼釀制釀制的樣品2產(chǎn)生的醇類風味物質含量最多，為153.75 mg/L。綜上所述，在大米糊化階段添加蝦殼釀造米醋，對米醋品質的影響最大，其抗氧化活性、蝦青素的含量以及揮發(fā)性風味物質的含量均高于其他樣品。

本研究采用了GC-MS和HPLC對不同米醋中的揮發(fā)性風味物質以及功能性成分進行分析，重點地研究了不同發(fā)酵階段添加蝦殼對米醋的風味物質成分和功能性物質的產(chǎn)生，為后續(xù)優(yōu)化液態(tài)釀造功能性米醋的發(fā)酵工藝提供理論指導。