王陳龍，邱 峰，操龍斌△，朱天川，曾令恒

1.南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院，廣東佛山 528244；2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東珠海 519000

膿毒癥作為一種由于感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，它是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、感染以及外科大手術(shù)常見(jiàn)并發(fā)癥，并且隨著病情進(jìn)展可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)器官功能障礙以及循環(huán)障礙，進(jìn)一步發(fā)展還可能引起患者膿毒癥休克，危及生命安全，因此研究膿毒癥發(fā)病機(jī)制對(duì)于掌握患者病情進(jìn)展情況，挽救患者生命有著重要意義[1-3]。外周血作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其單個(gè)核細(xì)胞既能夠有效反映宿主的免疫情況，又相對(duì)容易獲取，因此觀察外周血單個(gè)核細(xì)胞變化情況對(duì)研究膿毒癥的發(fā)展有著重要指導(dǎo)意義[4-5]。隨著近年來(lái)醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為研究復(fù)雜高通量小分子蛋白的主流工具，而數(shù)據(jù)非依賴(DIA)技術(shù)則是通過(guò)對(duì)所有母離子選擇、碎裂，采集母離子的全部離子信息，能夠大規(guī)模、高通量地做到相對(duì)定量和絕對(duì)定量。為此，南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院以及中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院基于數(shù)據(jù)非依賴性采集高分辨率色譜-質(zhì)譜技術(shù)(DIA LC-MS)對(duì)膿毒癥患者外周血差異蛋白進(jìn)行研究分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院以及中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院2018年8月至2019年8月重癥監(jiān)護(hù)室收治的60例膿毒癥患者作為觀察組，同時(shí)將上述兩所醫(yī)院同一時(shí)期入住重癥監(jiān)護(hù)室的術(shù)后未并發(fā)膿毒癥的60例患者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者存在明確感染證據(jù)，序貫器官衰竭評(píng)估(SOFA評(píng)分)變化≥2；(2)患者家屬知情并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者存在自身免疫疾病；(2)合并嚴(yán)重肝、腎功能不全者；(3)患者近半年內(nèi)使用過(guò)免疫抑制藥物。觀察組中男33例，女27例；年齡35～79歲，平均(61.5±4.8)歲；肺部感染24例，腹腔感染12例，泌尿系感染15例，其他部位感染19例。對(duì)照組中男31例，女29例；年齡34～76歲，平均(61.2±4.7)歲。兩組研究對(duì)象在性別、年齡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞蛋白標(biāo)本制備 疑似膿毒癥患者在重癥監(jiān)護(hù)室發(fā)生高熱后，留取高熱血培養(yǎng)的同時(shí)取外周靜脈血5 mL，床邊EDTA管抗凝，于4 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室分類提取外周血單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.2質(zhì)譜蛋白標(biāo)本制備 在BCA法測(cè)定患者蛋白水平后取50 μg蛋白，加入6 mol/L尿素反應(yīng)30 min，55 ℃下 加入5 mmol/L TCEP還原反應(yīng)30 min，然后加入碘乙酰胺控制水平為6.25 mmol/L，避光反應(yīng)1 h，加入碳酸氫銨稀釋后再加入1 mmol/L氯化鈣，堿性環(huán)境中使胰酶變性，37 ℃下反應(yīng)16 h，除鹽后冷凍干燥。

1.2.3采集質(zhì)譜數(shù)據(jù) 采用EASY nLC-1000 UPLC系統(tǒng)聯(lián)合Orbitrap質(zhì)譜檢測(cè)器Q-Exactive plus質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，上樣量1 μg，在同一根自制C18分析柱上進(jìn)行。分離相：A相為0.1%甲酸，B相為0.1%甲酸加80%乙腈，環(huán)境溫度控制在4 ℃。梯度洗脫程序：0～5 min，A相97%～93%，B相3%～7%；>5～55 min，A相93%～78%，B相7%～22%；>55～65 min，A相78%～65%，B相22%～35%；>65～68 min，A相65%～20%，B相35%～80%；>68～75 min，A相20%，B相80%。

1.2.4質(zhì)譜方法 DDA掃描：采用正離子掃描，范圍為400～1 200 m/z，時(shí)間75 min。一級(jí)掃描模式為全掃描，范圍為400～1 200 m/z，一級(jí)檢測(cè)軌道分辨率70 000 FWHM@200 m/z；自動(dòng)增益控制為3×106，最長(zhǎng)注射離子時(shí)間為50 ms，電荷數(shù)2～7，loop count 20，二級(jí)質(zhì)譜碎裂模式HCD，碰撞能量NCE為27%，二級(jí)自動(dòng)增益控制為5×105。DIA數(shù)據(jù)采集：一級(jí)掃描模式為全掃描，范圍為400～1 200 m/z，一級(jí)檢測(cè)軌道分辨率35 000 FWHM@ 200 m/z，AGC為5×105，窗口為32個(gè)固定窗口，每個(gè)窗口分別為選擇、碎裂、采集母離子和全部子離子信息用于定量。

1.2.5數(shù)據(jù)及生物信息分析 DDA數(shù)據(jù)采用軟件Proteome Discoverer進(jìn)行搜庫(kù)，結(jié)果導(dǎo)入軟件Skyline建庫(kù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析提取。將篩選出的差異蛋白在DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中作KEGG通路分析、GO分析，從蛋白質(zhì)的生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分進(jìn)行基因富集分析。

1.2.6蛋白驗(yàn)證 采用雙抗體夾心酶免疫分析法(ELISA)測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞中生物標(biāo)志物的含量，試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1差異蛋白的篩選 兩組患者共獲得530 391個(gè)碎片離子，63 378個(gè)肽段，7 104個(gè)蛋白；60個(gè)DIA標(biāo)本采用Skyline共篩選鑒定得到147 363個(gè)碎片離子，21 840個(gè)肽段，6 213個(gè)蛋白。將碎片離子加和，共得到357個(gè)差異蛋白，其中93個(gè)高表達(dá)，264個(gè)低表達(dá)。為了更直觀地顯示不同差異蛋白在不同標(biāo)本間的表達(dá)差異，可根據(jù)顯著性差異蛋白表達(dá)量在標(biāo)本間進(jìn)行層次聚類。

2.2GO分析和通路分析 對(duì)這357個(gè)差異蛋白進(jìn)行GO分析顯示，富集最多的細(xì)胞組分是細(xì)胞外泌體、細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖1A；聚類到最多的生物功能是受體介導(dǎo)內(nèi)吞、細(xì)胞黏附反應(yīng)以及血小板脫顆粒，見(jiàn)圖1B，這些功能可能與膿毒癥的發(fā)展密切相關(guān)；最多見(jiàn)的分子功能是蛋白結(jié)合、poly(A)RNA結(jié)合、細(xì)胞黏附以及鐵離子結(jié)合，見(jiàn)圖1C；在對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行KEGG分析后顯示，細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、代謝通路、碳代謝通路、血小板激活、補(bǔ)體以及凝血瀑布這幾條通路與膿毒癥的發(fā)展密切相關(guān)，見(jiàn)圖1D。

注：A為細(xì)胞組分；B為生物過(guò)程；C為分子功能；D為KEGG通路。

2.3差異蛋白的驗(yàn)證 對(duì)357個(gè)差異蛋白進(jìn)行VIP值篩選，共篩選出138個(gè)差異蛋白，其中貢獻(xiàn)最大的分別是高遷移率蛋白(HMGB-1)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-8(MMP-8)，在進(jìn)行ELISA驗(yàn)證后顯示，觀察組患者HMGB-1、NGAL以及MMP-8表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者HMGB-1、NGAL以及MMP-8表達(dá)水平比較

2.4ROC曲線診斷模型 將兩組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行ELISA檢測(cè)后建立ROC曲線診斷模型顯示，HMGB-1靈敏度為0.832，特異度為0.865；NGAL靈敏度為0.802，特異度為0.668；MMP-8靈敏度為0.833，特異度為0.866。

3 討 論

目前膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但是臨床研究顯示免疫紊亂是膿毒癥發(fā)病的關(guān)鍵因素[6-7]?；颊咭坏┌l(fā)病后病情進(jìn)展迅速，臨床救治困難，這也是導(dǎo)致危重癥患者死亡的首要因素，研究顯示并發(fā)心肌損害更嚴(yán)重影響到患者臨床預(yù)后，近40%的患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的心肌損害，尤其是在新生兒敗血癥中更易出現(xiàn)，一旦出現(xiàn)心血管并發(fā)癥，患者病情就會(huì)急劇惡化，病死率可上升至70%～90%，因此了解膿毒癥的發(fā)病機(jī)制對(duì)于挽救患者生命安全有著重要意義[8]。

本研究顯示，在對(duì)兩組患者檢測(cè)后共獲得530 391個(gè)碎片離子，63 378個(gè)肽段，7 104個(gè)蛋白；60個(gè)DIA標(biāo)本采用Skyline共篩選鑒定得到147 363個(gè)碎片離子，21 840個(gè)肽段，6 213個(gè)蛋白。將碎片離子加和，共得到357個(gè)差異蛋白，其中93個(gè)高表達(dá)，264個(gè)低表達(dá)。正是這些蛋白的生物作用引發(fā)了促炎因子的釋放，加劇了患者膿毒癥的進(jìn)展，因此通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法可以更加直觀地了解膿毒癥的發(fā)病機(jī)制[9-10]。

研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥的發(fā)展與多種通路有關(guān)，免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重感染應(yīng)答失調(diào)，免疫調(diào)控由過(guò)度的免疫激活進(jìn)展至致死性免疫抑制。在對(duì)357個(gè)差異蛋白進(jìn)行GO分析顯示，富集最多的細(xì)胞組分是細(xì)胞外泌體、細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì)；聚類到最多的生物功能是受體介導(dǎo)內(nèi)吞、細(xì)胞黏附反應(yīng)以及血小板脫顆粒，這些功能可能與膿毒癥的發(fā)展密切相關(guān)。最多見(jiàn)的分子功能是蛋白結(jié)合、poly(A)RNA結(jié)合、細(xì)胞黏附以及鐵離子結(jié)合。在對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行KEGG分析后顯示，細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、代謝通路、碳代謝通路、血小板激活、補(bǔ)體以及凝血瀑布這幾條通路與膿毒癥的發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。而HMGB-1作為一種晚期炎癥遞質(zhì)，它的主動(dòng)分泌和被動(dòng)釋放能夠誘發(fā)患者出現(xiàn)局部炎癥，激發(fā)細(xì)胞因子超表達(dá)，加劇炎性反應(yīng)。而凋亡細(xì)胞的二次壞死釋放HMGB-1能夠級(jí)聯(lián)加劇單核/巨噬細(xì)胞的致炎反應(yīng)，因此膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞HMGB-1的高表達(dá)可能與免疫細(xì)胞炎癥的啟動(dòng)與維持，以及炎癥放大的級(jí)聯(lián)反應(yīng)存在密切聯(lián)系。NGAL作為急性腎損傷的生物標(biāo)志物之一，它由肝臟細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌，與細(xì)菌生長(zhǎng)和組織分化有密切關(guān)系，NGAL的升高可能與宿主感染細(xì)菌時(shí)自身免疫抗菌作用有關(guān)。MMP-8在正常情況下水平極低，它能夠激活巨噬細(xì)胞中NF-κB 促炎性轉(zhuǎn)錄因子，炎癥條件下MMP-8表達(dá)的升高導(dǎo)致患者組織的破壞[13-14]。本研究顯示，對(duì)357個(gè)差異蛋白進(jìn)行VIP值篩選，共篩選出138個(gè)差異蛋白，其中貢獻(xiàn)最大的分別是HMGB-1、NGAL以及MMP-8，在進(jìn)行ELISA驗(yàn)證后顯示，膿毒癥患者HMGB-1、NGAL以及MMP-8表達(dá)水平明顯高于非膿毒癥患者，并且HMGB-1靈敏度為0.832、特異度為0.865，NGAL靈敏度為0.802、特異度為0.668，MMP-8靈敏度為0.833、特異度為0.866，對(duì)患者臨床診治具有一定指導(dǎo)意義。

綜上所述，基于DIA LC-MS技術(shù)對(duì)膿毒癥患者外周血差異蛋白進(jìn)行研究后顯示，PLS-DA、OPLS-DA以及PCA模式能夠分析蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，初步篩選出HMGB-1、NGAL以及MMP-8作為膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的候選生物標(biāo)志物。