李 聰，邱昆成，謝致寬，謝裕彬，朱 偉*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

土茯苓是百合科光葉菝葜(Smilax glabraRoxb.)植物干燥根莖，具有解毒、除濕、通利關(guān)節(jié)的功效[1]。土茯苓含有生物堿、黃酮類、糖類等多種成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等藥理活性[2]。其中，具有免疫調(diào)節(jié)[3]、抗炎[4]等活性的多糖類成分逐漸被人們重視。然而，多糖的提取純化過程繁瑣，除蛋白是多糖純化過程中的重要步驟，土茯苓多糖提取工藝、脫色純化已有報道[5—6]，但是土茯苓多糖除蛋白工藝未見報道。

Sevage法條件溫和，具有適用性廣、經(jīng)濟和快速等優(yōu)點，是多糖溶液去除游離蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法。Sevage法利用蛋白質(zhì)與有機試劑接觸后變性從而形成膠狀雜質(zhì)的原理，通過離心將其分離除去，但是一般需要反復(fù)處理樣品多次，每次除去變性的蛋白膠狀物時，多糖可能隨著蛋白一起沉淀而損失；此外，有機溶劑在溶解雜質(zhì)后變得黏稠，同樣會在分離時造成部分多糖損失[7—8]。因此，優(yōu)化多糖除蛋白工藝，對減少多糖純化過程中的損失，提高多糖純度具有重要意義。目前多糖除蛋白研究大多僅以蛋白清除率為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化[9—10]，而忽略了除蛋白過程中多糖的損失。本實驗以蛋白清除率和多糖保留率為指標(biāo)，通過Sevage試劑法去除土茯苓粗多糖溶液的游離蛋白，在單因素實驗的基礎(chǔ)上運用響應(yīng)面分析法對土茯苓多糖除蛋白工藝進(jìn)一步優(yōu)化，以期為土茯苓多糖的深入研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藥材

土茯苓中藥飲片購自康美藥業(yè)股份有限公司(批號：160505781)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院袁小紅主任中藥師鑒定為百合科光葉菝葜(Smilax glabraRoxb.)干燥根莖，符合2015版《中國藥典》的規(guī)定。

1.1.2 主要試劑與儀器

考馬斯亮藍(lán) G250購自源葉生物科技有限公司(批號：L10A10G85391)。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購自大連美侖生物技術(shù)有限公司(批號：M0509AS)。牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自美國 MP Biomedicals 公司(批號：0218054991)。正丁醇、三氯甲烷、硫酸、重蒸苯酚均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；離心機(北京京立)；全波長酶標(biāo)儀(EonC)；渦旋振蕩器(Vortex genie2 scientific industries)；萬分之一分析天平(德國Sartorius)。

1.2 方法

1.2.1 土茯苓多糖提取

稱取土茯苓藥材1 kg，加入 6 L純水回流提取3次，每次2 h，將提取液合并，用紗布過濾并濃縮至1 L，然后加入95%乙醇至含醇量80%于4 ℃靜置過夜，離心，將沉淀用水復(fù)溶再次醇沉，一共醇沉3次，然后離心并將沉淀用超純水定容至300 mL，用時稀釋 10倍作為土茯苓多糖供試液。

1.2.2 多糖及蛋白質(zhì)含量測定

精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5.05 mg以及牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 10.03 mg，分別用超純水定容至5 mL和 50 mL，分別得到1.01 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和200.6 μg·mL-1牛血清白蛋白對照品溶液。將兩種標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋配制成系列對照品溶液，葡萄糖對照品的質(zhì)量濃度依次為10.1、20.2、30.3、40.4、50.5、60.6、80.8 μg·mL-1，牛血清白蛋白對照品的質(zhì)量濃度依次為1.003、5.015、20.06、50.15、60.18、70.21 μg·mL-1，然后以苯酚硫酸法檢測葡萄糖[11]，考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白質(zhì)[12]。分別以葡萄糖和牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.3 單因素實驗

以蛋白清除率和多糖保留率為指標(biāo)，確定Sevage試劑：供試液(V/V)、振搖強度、振搖時間和除蛋白次數(shù)的最優(yōu)參數(shù)。振搖強度由斡旋振蕩器不同擋位控制(可控?fù)跷?～10擋)，基本的除蛋白工藝為：Sevage試劑：供試液1:5，振搖擋數(shù)6擋，振搖時間 10 min，除蛋白次數(shù) 5次，除蛋白后以3000 r·min-1離心10 min取上清液，測定土茯苓多糖和蛋白濃度，計算蛋白清除率和多糖保留率。

單因素實驗中，Sevage試劑與供試液的比例設(shè)1:5、1:4、1:3、1:2，以斡旋振蕩器設(shè)4擋、6擋、8擋、10擋振搖，振搖時間設(shè)為5、10、15、20 min，除蛋白次數(shù)設(shè)3、5、7、9次，分析其對多糖保留率以及蛋白清除率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計

通過單因素的實驗，以 Sevage試劑：供試液、振搖強度、振搖時間、除蛋白次數(shù)為設(shè)計因素，采用Design Expert 8.0.5b分析軟件中Box-Behnken方案，設(shè)計出4因素3水平實驗。設(shè)計因素水平及編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平編碼Table 1 Coding of Box-Behnken test design factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量及蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.2項繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0067X+0.0086(R2=0.9996)、蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0042X+0.23(R2=0.9991)。

2.2 單因素對多糖保留率及蛋白清除率的影響

2.2.1 Sevage試劑與供試液比例

從圖 1: A中可以看出，隨著多糖供試液中Sevage試劑的增加，多糖保留率先上升后下降，在Sevage試劑：供試液為1:4處有最大值；蛋白清除率則先保持平穩(wěn)然后升高。這可能是增加Sevage試劑，除蛋白的效率增加，故多糖保留率增加，當(dāng)Sevage試劑達(dá)到一定比例后，植物蛋白呈凝膠樣大量析出，同時也導(dǎo)致部分多糖被包裹除去，Sevage試劑：供試液為1：3、1：2時多糖保留率顯著降低。因此，Sevage試劑與多糖供試液的最佳比例為1:4。

2.2.2 振搖強度

由圖1: B可知，隨著振搖強度增加，土茯苓多糖保留率先上升，在8擋處有最大值，然后顯著下降；蛋白清除率從4擋到10擋均無明顯變化。故振搖強度為斡旋振蕩器8擋最佳。

2.2.3 振搖時間

由圖1: C可知，隨著振搖時間延長，土茯苓多糖保留率先升高后下降，然后再上升，因為振搖時間增加，Sevage試劑與供試液接觸更加充分，植物蛋白凝膠初步形成時包裹的多糖被釋放，故多糖保留率增加。繼續(xù)振搖，植物蛋白凝膠均勻分布，類似于形成乳劑對多糖重新包裹，導(dǎo)致多糖保留率降低。而振搖時間達(dá)到一定程度，乳劑被破壞，多糖保留率再次上升。當(dāng)振搖10 min和20 min時，多糖保留率最高，而蛋白清除率從5 min到20 min一直呈降低的趨勢，雖然振搖20 min時多糖保留率比振搖10 min略高，但是蛋白清除率亦明顯下降，所以最佳振搖時間為10 min。

2.2.4 除蛋白次數(shù)

由圖1: D可知，當(dāng)除蛋白次數(shù)逐漸增加，多糖保留率先逐漸降低然后保持平穩(wěn)，蛋白清除率逐漸增加然后保持平穩(wěn)。因此，除蛋白次數(shù)過多并不能增加蛋白清除率，而多糖保留率降低到一定程度便不再受除蛋白次數(shù)的影響。當(dāng)除蛋白次數(shù)為5次時，多糖保留率較高，而蛋白清除率達(dá)到最高水平，故5次為除蛋白最佳次數(shù)。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化土茯苓除蛋白工藝結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken實驗設(shè)計與回歸模型建立

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以Sevage試劑與供試液比(A)、振搖強度(B)、振搖時間(C)、除蛋白次數(shù)(D)四個因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，設(shè)計四因素三水平共計27組實驗，其中24個析因?qū)嶒灒?個中心實驗，實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

利用Design-Expert8.0.5b實驗軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方程擬合分析，得到以多糖保留率(Y1)和蛋白清除率(Y2)為響應(yīng)值的二次多項回歸方程為：

分別對多糖保留率和蛋白清除率的回歸模型及各參數(shù)的顯著性進(jìn)行驗證。在多糖保留率為響應(yīng)值的模型分析里，模型的P值為0.9819＞0.05，模型不顯著；多糖保留率的回歸方程系數(shù)為A=0.6838、B=0.9263、C=0.8690、D=0.6383，均大于0.05表明Sevage試劑與供試液比、振搖強度、振搖時間、除蛋白次數(shù)四個因素對多糖保留率的影響不明顯。在蛋白清除率為響應(yīng)值的模型分析里，模型的P值為0.0033＜0.05，R2=0.8600，失擬項P=0.0671>0.05，表明模型顯著，擬合程度較好，模擬的失擬程度不顯著。蛋白清除率的回歸方程系數(shù)D=0.0233＜0.05，除蛋白次數(shù)D對響應(yīng)值影響顯著(表3)。

圖1 不同因素對土茯苓多糖保留率及蛋白清除率的影響Fig. 1 Effects of various factors on the deproteinization efficiency and retention rate of polysaccharides extracted from Smilax glabra Roxb.

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The response surface experiment design and results

表3 蛋白清除率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析Table 3 The ANOVA of regression model with deproteinization efficiency as response value

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化工藝分析

利用 Design-Expert 軟件繪制出交互項的響應(yīng)值的三維表觀圖(圖2)。由圖可知，曲面陡峭程度較大，振搖強度和振搖時間以及除蛋白次數(shù)兩兩間交互作用顯著。圖2: a和圖2: c表明蛋白清除率隨著振搖時間、振搖強度、振搖次數(shù)的增大，呈先增大后減小的趨勢，曲面陡峭程度較大，在優(yōu)化區(qū)域內(nèi)存在最大值。由圖2: b可知，蛋白清除率隨著振搖次數(shù)的增加，振搖次數(shù)越多，振搖強度對蛋白清除率的影響越明顯。優(yōu)化的最佳除蛋白工藝條件為Sevage試劑：供試液=1:3、振搖強度 8.38擋、振搖時間10.09 min、除蛋白次數(shù)5.37次，最終蛋白清除率為98.50%。

圖2 各因素交互作用對土茯苓多糖溶液蛋白清除率的響應(yīng)面圖Fig. 2 The response surface map of the interaction of various factors on the deproteinization efficiency of Smilax glabra Roxb.polysaccharide

2.4 驗證實驗

為驗證實驗的準(zhǔn)確性和回歸模型的可靠性，參考模型得出的最佳除蛋白工藝，實際操作中，采用Sevage試劑：供試液=1:3、振搖強度8擋、振搖時間10 min、除蛋白次數(shù)5次。平行3組實驗，取平均值，蛋白清除率為97.39%，與理論值相差1.11%，相差較小，重復(fù)性好，說明該回歸模型穩(wěn)定可靠，可用于指導(dǎo)土茯苓多糖除蛋白，此條件下多糖保留率為74.13%。

3 討論

中藥多糖是當(dāng)前研究熱點，其提取方法雖然較多，但是在提取過程中都會將植物蛋白一并提取，而除蛋白的過程十分繁瑣，添加的試劑比例和除蛋白次數(shù)等因素，不僅會影響除蛋白效率，同時會對多糖含量造成損失，降低多糖純化效率，增加純化成本，不利于多糖的大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用。優(yōu)化除蛋白的工藝對于提高多糖純度、增加多糖藥理活性、提高多糖純化效率、節(jié)省試劑降低成本具有重要意義。

本實驗中多糖保留率的響應(yīng)面模型不夠顯著，說明除蛋白過程中的步驟對多糖造成的損失有限。然而單因素實驗表明，Sevage試劑與供試液比、振搖強度、振搖時間和除蛋白次數(shù)對多糖保留率確有一定的影響，優(yōu)化后的土茯苓多糖除蛋白工藝，振搖強度8擋、振搖時間10 min、除蛋白次數(shù)5次與單因素實驗結(jié)果相符，蛋白清除率和多糖保留率均處于較高水平。在單因素實驗中，Sevage試劑：供試液為1:4時，多糖保留率最高為78.02%、蛋白清除率僅85.16%；Sevage試劑：供試液為1:3時，蛋白清除率高達(dá)96.03%，但多糖保留率只有61.58%。當(dāng)除蛋白工藝優(yōu)化之后，Sevage試劑與供試液的最優(yōu)比例為1:3，與Sevage試劑：供試液為1:3的單因素實驗相比，蛋白清除率提高1.36%，達(dá)97.39%，土茯苓多糖保留率達(dá)74.13%，提高12.55%；和Sevage試劑：供試液為1:4的單因素實驗相比，多糖保留率只降低3.89%，但是蛋白清除率提高12.2%。由此可見，優(yōu)化土茯苓多糖除蛋白工藝，對于提高蛋白清除率，增加多糖保留率效果顯著，為土茯苓多糖的深入研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。