馮學(xué)召， 伊力亞斯·艾薩， 雷秀英， 陳 倩， 古麗努爾·阿不力米提， 米 娜

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 2藥學(xué)院藥理學(xué)教研室， 3第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院， 烏魯木齊 830011)

自噬是真核細(xì)胞中相對(duì)保守的生命過(guò)程，通過(guò)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹細(xì)胞內(nèi)待降解的物質(zhì)形成自噬體。自噬體外膜與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體，并降解內(nèi)容物，供細(xì)胞物質(zhì)循環(huán)再利用[1]。自噬溶酶體的形成機(jī)制受多種因素的影響，如促進(jìn)突觸融合蛋白質(zhì)17 (syntaxin 17, STX17)與自噬體相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用，精確調(diào)控同型融合與蛋白分選復(fù)合體(homotypic fusion and protein sorting, HOPS)向自噬體的募集，促進(jìn)與溶酶體融合，從而形成自噬溶酶體[2]。然而，在自噬體與溶酶體融合過(guò)程中，自噬體是如何運(yùn)輸?shù)饺苊阁w的機(jī)制尚不完全清楚。肌球蛋白同細(xì)胞骨架共同維持細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，對(duì)囊泡、蛋白復(fù)合體、細(xì)胞膜等特殊物質(zhì)進(jìn)行分類、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配過(guò)程中具有重要的作用[3-5]。肌球蛋白1D(myosin1d, MYO1D)是一類廣泛表達(dá)的肌球蛋白，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)膜泡的運(yùn)輸及器官的發(fā)育[6]。在細(xì)胞內(nèi)，MYO1D運(yùn)輸囊泡在肌動(dòng)蛋白(actin)富集區(qū)[7]，MYO1D與膜泡結(jié)合后，可以將膜泡從細(xì)胞膜向細(xì)胞胞質(zhì)膜進(jìn)行運(yùn)輸，或與肌動(dòng)蛋白纖維絲相互作用促進(jìn)膜泡運(yùn)輸[8]。為探究MYO1D對(duì)自噬體膜泡的運(yùn)輸以及自噬溶酶體的形成是否有影響，本研究擬通過(guò)分子生物等技術(shù)方法，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并分析MYO1D在自噬溶酶體形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)，New Brunswick GALAXY 170R)；生物安全柜(美國(guó)，Thermo scientific KS 18公司)；激光共聚焦顯微鏡(日本，尼康)；垂直電泳槽垂直凝膠電泳儀及相關(guān)配套設(shè)備半干式轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)，BIO-RAD 公司)；高速低溫離心機(jī)(美國(guó)，Sigma公司)；anti-LC3、anti-P62、anti-Lamp-1一抗(日本，MBL 公司)；β-actin一抗(美國(guó)，Sigma-Aldrich 公司)；anti- Myosin 1D一抗(美國(guó)，Santa Cruze試劑公司)；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗(美國(guó)， Southern Bioteh公司)；Lyso-Tracker Red熒光探針與Alexa Fluor熒光標(biāo)記的二抗(美國(guó)，Thermo Fisher Scientific公司)；VigoFect試劑(北京，威格拉斯生物技術(shù)有限公司)；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒(北京，康為世紀(jì)生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)，Gibco公司)；胎牛血清、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(美國(guó)，Hyclone)；MYO1D-grna，PX459M質(zhì)粒(上海，生物工程(上海)有限責(zé)任公司)；大鼠腎上皮細(xì)胞(normal rat kidney ,NRK)、綠色熒光蛋白-紅色熒光蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(green fluorescent protein-red fluorescent protein-microtubule associated protein 1 light chain 3,GFP-RFP-LC3)質(zhì)粒由清華大學(xué)俞立課題組贈(zèng)與。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇細(xì)胞，配制含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素、1%谷氨酰胺的高糖完全培養(yǎng)基，并置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞的匯合率達(dá)到95%時(shí)，細(xì)胞以1∶3～1∶4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將大鼠腎上皮細(xì)胞(normal rat kidney,NRK)以3×105個(gè)/mL密度接種于六孔板中制作爬片，饑餓處理2、4 h，PBS沖洗1次，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%皂素打孔10 min，山羊血清室溫封閉30 min，一抗室溫孵育1 h, PBS沖洗4次;二抗室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3次；封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄自噬體標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light Chain 3, LC3)與肌球蛋白1D(myosin1d, MYO1D)的共定位關(guān)系。

1.2.3 MYO1D敲除細(xì)胞的建立 取正常培養(yǎng)狀態(tài)良好的NRK細(xì)胞，采用CRISPR-Cas9技術(shù)電穿孔法將MYO1D-gRNA與PX459M質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，加入嘌呤霉素1 μg/μL進(jìn)行篩選，連續(xù)用藥直至長(zhǎng)出單個(gè)細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。免疫印跡檢測(cè)正常培養(yǎng)的MYO1D基因未敲除組，即NC組(non-specific control, NC)與MYO1D基因敲除組，即KO組(Myosin1d knockout, KO)中MYO1D的表達(dá)水平，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NRK細(xì)胞以3×105個(gè)/mL的密度均勻接種于六孔板，培養(yǎng)14 h后，PBS沖洗3次，DPBS分別饑餓處理2、4 h。隨后，棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗1次，加入十二烷基磺酸鈉蛋白裂解液，100℃變性15 min，在12%SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，室溫孵育抗體1 h，采用電化學(xué)發(fā)光法(electrochemiluminescence, ECL)進(jìn)行X-線片顯影。兩組細(xì)胞經(jīng)DMEM培養(yǎng)基中饑餓處理4 h后采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)內(nèi)源性LC3與溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白1 (lysosomal associated membrane protein 1, LAMP1)，通過(guò)圖片合并(Merge)觀察兩者共定位關(guān)系，熒光擬合度分析其定位程度?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)兩組細(xì)胞自噬底物蛋白P62(p62/sequestosom-1,p62)的表達(dá)水平。

1.2.5 Lyso-tracker Red檢測(cè) 將NRK細(xì)胞按1×105個(gè)/mL密度均勻接種至四孔玻底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12 h后，PBS沖洗1次，加入含1 mg/mL Lyso-Tracker Red探針的完全培養(yǎng)基對(duì)兩組溶酶體進(jìn)行特異性染色，培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，PBS沖洗3次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察溶酶體活性的變化并對(duì)熒光灰度值進(jìn)行分析。

1.2.6 GFP-RFP-LC3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞匯合率達(dá)到50%～60%時(shí)，VigoFect試劑轉(zhuǎn)染GFP-RFP-LC3質(zhì)粒至兩組細(xì)胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h，DMEM培養(yǎng)基中饑餓處理4 h，激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬溶酶體比例的變化。

2 結(jié)果

2.1 MYO1D與自噬體LC3的定位關(guān)系激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，MYO1D與LC3具有顯著的共定位關(guān)系，見(jiàn)圖1。

綠色點(diǎn)標(biāo)記MYO1D

紅色點(diǎn)標(biāo)記LC3

黃色點(diǎn)標(biāo)記MYO1D與LC3的共定位

2.2 MYO1D基因敲除細(xì)胞的建立采用CRISPR-Cas9技術(shù)，對(duì)NRK細(xì)胞中的MYO1D基因進(jìn)行敲除。結(jié)果顯示，NRK細(xì)胞中MYO1D基因被成功敲除，見(jiàn)圖2。

2.3 MYO1D對(duì)自噬溶酶體的形成及P62蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響與NC組比較，KO組LC3與LAMP1共定位程度顯著減少，熒光擬合程度降低，見(jiàn)圖3、4。與NC組比較，KO組P62蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

圖2 MYO1D基因敲除細(xì)胞的建立

圖3 兩組細(xì)胞LC3與LAMP1的共定位關(guān)系(×600)

圖4 兩組細(xì)胞熒光擬合度分析

2.4 MYO1D對(duì)自噬溶酶體的形成及對(duì)溶酶體活性的影響兩組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP-RFP-LC3質(zhì)粒結(jié)果顯示，與NC組比較KO組內(nèi)綠色熒光與紅色熒光共同標(biāo)記的自噬體比例升高，見(jiàn)圖5。饑餓處理2、4 h后顯示，與NC組比較KO組溶酶體活性未被抑制，反之呈增高趨勢(shì)，MYO1D基因敲除未影響溶酶體活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 兩組細(xì)胞P62蛋白質(zhì)表達(dá)水平的比較

注：綠色、黃色標(biāo)記點(diǎn)為自噬體，紅色標(biāo)記點(diǎn)為自噬溶酶體。

表2 兩組細(xì)胞溶酶體活性熒光灰度值分析

3 討論

自噬溶酶體的形成是細(xì)胞自噬的重要階段，在細(xì)胞自噬中起到關(guān)鍵作用，若自噬溶酶體的形成受到障礙則會(huì)導(dǎo)致帕金森[9]、阿爾茲海默癥[10]及神經(jīng)退行性疾病[11]。自噬體與溶酶體的融合需要如HOPS蛋白質(zhì)復(fù)合體在自噬體與溶酶體靠近后促進(jìn)兩膜的融合[12-13]，同時(shí)自噬體與溶酶體的靠近也需要相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的運(yùn)輸[14 ]。自噬體從形成并轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體的過(guò)程中，參與運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)與自噬體之間的相互作用對(duì)自噬體的轉(zhuǎn)運(yùn)起關(guān)鍵作用[15]。本研究通過(guò)免疫熒光檢測(cè)觀察到MYO1D與自噬相關(guān)蛋白LC3有顯著的共定位關(guān)系，這提示MYO1D參與細(xì)胞自噬。在正常生理情況下，自噬體底物與P62結(jié)合后被自噬體包裹，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并最終降解[16]。本研究通過(guò)觀察MYO1D對(duì)自噬溶酶體形成的影響發(fā)現(xiàn)，與NC組比較KO組自噬溶酶體形成減少，P62表達(dá)水平顯著升高，即MYO1D蛋白參與自噬并抑制自噬過(guò)程。而MYO1D敲除引起自噬溶酶體的減少，P62表達(dá)水平升高可能是由于MYO1D敲除影響了溶酶體的活性，導(dǎo)致自噬過(guò)程的減弱以及自噬溶酶體數(shù)量的減少。Lyso-Tracker red熒光探針觀察溶酶體活性檢測(cè)[17]結(jié)果顯示，KO組溶酶體活并未受到影響。轉(zhuǎn)染GFP-RFP-LC3質(zhì)粒結(jié)果表明，MYO1D影響了自噬溶酶體的形成，這與前實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致?？梢哉J(rèn)為MYO1D可能是影響自噬體的運(yùn)輸以及與溶酶體融合形成自噬溶酶體的關(guān)鍵蛋白。而MYO1D關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域參與自噬溶酶體的形成，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。