張廣求， 張美祥， 譚 璐

(黃岡市中心醫(yī)院藥劑科； 長江大學(xué)黃岡臨床醫(yī)學(xué)院， 湖北 黃岡 438000)

參菊洗劑是黃岡市中心醫(yī)院根據(jù)臨床驗方研制的中藥外用洗劑，主要由苦參、野菊花、黃柏、蛇床子等中藥組成，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、殺蟲止癢功效，用于濕毒所致的細菌性、真菌性、滴蟲性陰道炎及皮膚瘙癢癥的治療，具有較好的臨床療效[1-2]。本課題組前期對參菊洗劑的體外抑菌、抗過敏、殺蟲止癢作用及皮膚刺激性、急性毒性等進行了研究[3-6]。 本研究采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹、醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加、角叉菜膠致大鼠足跖腫脹3種炎癥模型，探究參菊洗劑的抗炎作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥參菊洗劑(含生藥量為0.54 g/mL，黃岡市中心醫(yī)院藥劑科自制，批準文號：鄂藥制字Z20180800，批號：180328，180415，180502)，潔爾陰洗液(含生藥量為1 g/mL，四川恩威制藥有限公司，批號：1704003)，0.9%氯化鈉注射液(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：170401-0504)，硫化鈉(天津大茂化學(xué)試劑廠，批號：201700916)，乙醚(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號：20180322)，二甲苯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20160216)，伊文思藍(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20150729)，冰醋酸(廣州市番禺力強化工廠，批號：20170615)，角叉菜膠(美國SIGMA公司，批號：SLBK3896V)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20180322)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20180328)，前列腺素E2(PGE2)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號：20180519)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號：20180428)。

1.2 儀器ZH-YLS-Q4型鼠耳打孔器(原陽縣振華教學(xué)儀器有限公司)，YLS-7B型足跖容積測量儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司)，AL104型電子天平[梅特勒托利多儀器(上海)有限公司]，Allegra 64R型高速冷凍離心機(美國BECKMAN公司)，F(xiàn)SH-2A型可調(diào)高速勻漿機(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)，TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，T6型新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，Multiskan FC型酶標儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司]，HS-80TW-1DF型電子秒表(深圳市博迅達電子科技有限公司)。

1.3 實驗動物KM小鼠，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購買于三峽大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2017-0012。SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20) g，購買于湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。所有動物均自由攝食和飲水，在室溫度(20～26)℃，相對濕度40%～70%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d。動物使用許可證號：SYXK(鄂)2014-0083。本實驗方案及操作均符合醫(yī)學(xué)動物實驗倫理學(xué)要求。

1.4 實驗方法

1.4.1 抗二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗[7]取小鼠50只，雌雄各半，用乙醚麻醉，分別在小鼠右耳廓前后兩面均勻涂布20 μL二甲苯，致炎后隨機分為5組：參菊洗劑低、中、高劑量組(參菊洗劑0.054、0.108、0.216 g/mL)，陽性對照組(10%潔爾陰洗液，0.1 g/mL)，模型對照組(0.9%氯化鈉注射液)，每組10只。另取小鼠10只，雌雄各半，不進行任何處理作為空白對照組。在致炎后0.5、1.0、2.0 h分別在各組小鼠右耳廓炎癥部位涂抹相應(yīng)藥物，每次50 μL，各組小鼠左耳不作任何處理。致炎4 h后用乙醚淺表麻醉小鼠，頸椎脫臼處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用鼠耳打孔器于左、右耳相同部位取下圓形耳片，用電子天平稱取質(zhì)量，以同一只小鼠兩耳片質(zhì)量差為腫脹度，計算各組小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率，耳腫脹度=右耳片質(zhì)量/mg-左耳片質(zhì)量/mg；腫脹抑制率/%=[(模型對照組腫脹度均值-給藥組腫脹度均值)/模型對照組腫脹度均值]×100%。

1.4.2 抗醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性實驗[8]取小鼠50只，雌雄各半，每只小鼠腹部同一部位各脫毛2 cm×3 cm，隨機分為5組，每組10只,分別為：參菊洗劑低、中、高劑量組(參菊洗劑0.054、0.108、0.216 g/mL)，陽性對照組(10%潔爾陰洗液，0.1 g/mL)，模型對照組(0.9%氯化鈉注射液)。脫毛24 h后，分別在各組小鼠脫毛區(qū)均勻涂抹相應(yīng)藥物，每次0.1 mL，每天2次，連續(xù)3 d。末次給藥30 min后，于小鼠尾靜脈注射含0.5%伊文思藍的0.9%氯化鈉注射液0.2 mL，腹腔注射0.7%醋酸溶液0.2 mL致炎，20 min后，用乙醚淺表麻醉小鼠，頸椎脫臼處死，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液6 mL，反復(fù)輕柔腹部20次，吸出腹腔液于3 000 r/min (r=10 cm)離心5 min，取上清液，用分光光度計測定590 nm處的吸光度，計算腹腔毛細血管通透性抑制率。腹腔毛細血管通透性抑制率/%= [(模型對照組平均吸光度-給藥組平均吸光度)/模型對照組平均吸光度]×100%。

1.4.3 抗角叉菜膠致大鼠足跖腫脹實驗[9]取后肢足跖正常無損傷的大鼠50只，雌雄各半，將大鼠右后下肢外側(cè)脫毛處理，分別測定右后足跖體積，作為致炎前的足跖體積。將大鼠隨機分為5組，每組10只，分別為：參菊洗劑低、中、高劑量組(參菊洗劑0.054、0.108、0.216 g/mL)，陽性對照組(10%潔爾陰洗液，0.1 g/mL)，模型對照組(0.9%氯化鈉注射液)。將各組大鼠右后足跖分別置于相應(yīng)藥液中浸泡180 s，各組大鼠分別于1、2 h后右后足跖中部皮下注射1%角叉菜膠混懸液(用0.9%氯化鈉注射液配制)0.1 mL致炎，測量各組大鼠致炎后1、2、3、4 h時右后足跖體積。以大鼠致炎前、后足跖體積的差值為腫脹度，比較各組大鼠足跖腫脹度的差異，腫脹度/mL=致炎后足跖體積-致炎前足跖體積。

1.4.4 對炎癥大鼠血清和足跖組織中SOD、MDA、PGE2、TNF-α的影響 將“1.4.3”項下測量給藥后4 h足跖體積的大鼠用乙醚麻醉，摘眼球取血，頸椎脫臼處死。全血靜置30 min后，3 000 r/min (r=10 cm)離心10 min，取上層血清，置于4℃冰箱中冷藏，備用。按照試劑盒說明書操作，分別測定血清中MDA、PGE2、TNF-α水平和SOD活性。在踝關(guān)節(jié)處剪下各組大鼠右后足跖，稱定質(zhì)量后剪碎，以4℃預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液制成10%組織勻漿，4℃下3 000 r/min (r=10 cm)離心10 min，取上清液，置于4℃冰箱中冷藏，備用。按照試劑盒說明書操作，分別測定足跖組織中MDA、PGE2、TNF-α水平和SOD活性。

2 結(jié)果

2.1 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹抑制率的影響與模型對照組比較，參菊洗劑各劑量和陽性對照組小鼠腫脹抑制率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01～0.05)。與陽性對照組比較，菊洗劑高劑量組小鼠腫脹抑制率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 參菊洗劑對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

2.2 對醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響與模型對照組比較，參菊洗劑各劑量和陽性對照組小鼠腹腔毛細血管通透性抑制率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01～0.05)。與陽性對照組比較，菊洗劑高劑量組小鼠腹腔毛細血管通透性抑制率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 參菊洗劑對醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響

2.3 對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響與模型對照組比較，參菊洗劑各劑量和陽性對照組大鼠在致炎后1、2、3、4 h大鼠足跖腫脹度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01～0.05)。與陽性對照組比較，參菊洗劑高劑量組在致炎后1、2、3、4 h大鼠足跖腫脹度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 參菊洗劑對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響

2.4 對炎癥大鼠血清和足跖組織中SOD、MDA、PGE2、TNF-α水平的影響與模型對照組比較，參菊洗劑各劑量和陽性對照組大鼠血清中SOD水平升高，MDA和TNF-α水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01～0.05)。與陽性對照組比較，參菊洗劑中、高劑量組大鼠血清中SOD水平升高，參菊洗劑高劑量組大鼠血清中MDA和TNF-α水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表4。與模型對照組比較，參菊洗劑各劑量和陽性對照組大鼠足跖組織中SOD水平升高，MDA、PGE2和TNF-α水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01～0.05)。與陽性對照組比較，參菊洗劑中、高劑量組大鼠足跖組織中SOD水平升高，參菊洗劑高劑量組大鼠足跖組織中MDA和TNF-α水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表5。

表4 參菊洗劑對大鼠血清中SOD、MDA、PGE2、TNF-α水平的影響

表5 參菊洗劑對大鼠足跖組織中SOD、MDA、PGE2、TNF-α水平的影響

3 討論

炎癥是臨床較常見的病理生理過程，是機體對有害刺激所產(chǎn)生的復(fù)雜的防御反應(yīng)，在該過程中，巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞等炎癥細胞釋放的PGE2、TNF-α等多種炎癥因子都有參與。炎癥的發(fā)展一般分為早、中、晚三期，急性炎癥或炎癥早期的主要表現(xiàn)是毛細血管擴張、通透性增加、滲出和水腫，中期表現(xiàn)為血小板吸附及白細胞游走，晚期為肉芽組織增生[10]。SOD是生物體內(nèi)重要的內(nèi)源性活性蛋白酶，能催化超氧化物自由基分解，清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生引起的炎癥反應(yīng)，保護細胞、組織免受氧化損傷，有效抵抗氧自由基對機體的傷害[11-12]。炎癥細胞產(chǎn)生的氧自由基，攻擊細胞膜、線粒體膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成過氧化脂質(zhì)，進一步分解為MDA。測定MDA的水平，可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度及細胞受自由基攻擊的程度[13]。PGE2是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，是一種活性很強的炎癥因子，具有擴張血管、致熱、致痛等生物活性，可通過加強組胺及緩激肽的效應(yīng)而引起血管通透性增強、加強其他趨化因子的作用而使白細胞向炎區(qū)聚集，從而引起水腫、充血、局部紅斑等炎癥反應(yīng)。本研究表明，參菊洗劑能明顯降低大鼠足跖炎癥組織中PGE2含量，但各組大鼠血清PGE2含量均未有顯著變化?？赡苁怯捎谘錚GE2主要來源于血管內(nèi)皮細胞和血小板，在炎癥反應(yīng)過程中未受到明顯刺激，故血清PGE2的含量就沒有明顯變化；而足跖炎癥組織因致炎物質(zhì)角叉菜膠的刺激使PGE2合成增多。因此，抗炎藥能抑制局部組織中PGE2合成發(fā)揮抗炎作用，而對血清中PGE2含量無明顯影響[14]。TNF-α是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，通過誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，特別是T細胞和巨噬細胞的活化，促進炎癥反應(yīng)和組織損傷；同時，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生急性時相反應(yīng)蛋白，作用于血管內(nèi)皮細胞，使之分泌趨化性細胞因子，從而趨化單核細胞及中性粒細胞，并刺激其活化，釋放出多種炎癥因子，引起炎癥反應(yīng)[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，參菊洗劑對二甲苯致小鼠耳廓腫脹、醋酸致小鼠毛細血管通透性增加和角叉菜膠致大鼠足跖腫脹均有良好的抑制作用，其抗炎機制與提高SOD活性，增強清除自由基能力，抑制脂質(zhì)體過氧化和MDA、PGE2、TNF-α等炎癥因子的合成與釋放有關(guān)。證實參菊洗劑外用具有較好的抗炎作用，為其臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。