曾洪波 宋春華 彭 璟 楊秀麗 張曉彧 李爽樂

(自貢市第一人民醫(yī)院眼科，自貢 643000)

青光眼是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征是病理性高眼壓和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)進行性凋亡，是全球不可逆致盲最重要的病因之一[1-3]。有研究表明，RGCs在受損導(dǎo)致的凋亡過程中，其自噬水平會明顯升高。細(xì)胞生長過程中基礎(chǔ)水平的自噬可維持細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，具有保護細(xì)胞的作用[4-6]，但是在多種疾病模型中自噬反而會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7,8]。自噬對于細(xì)胞凋亡的這種雙重性作用在神經(jīng)退行性疾病中也存在[9]。氯喹(chloroquine，CQ)是一種抗瘧藥，是常見的抗風(fēng)濕藥物，也是常見的自噬抑制劑[10]。目前，國內(nèi)關(guān)于CQ與RGCs凋亡之間關(guān)系的研究比較少。本研究通過觀察CQ和氯化鈷(CoCl2)作用后RGCs的凋亡與自噬水平的變化，闡明CQ對缺氧誘導(dǎo)的RGCs凋亡的影響，為治療青光眼提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC-5購于ATCC，用含10%胎牛血清、1%雙抗(美國Gibco公司)DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CQ購自Sigma公司，抗小鼠LC3B、Caspase-3抗體及二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，其他試劑購自國藥集團。Loading buffer、RIPA裂解液及細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天公司，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green qPCR Mix購自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1qPCR RGC-5以5×105個/孔接種于6孔板中，過夜細(xì)胞貼壁后，分別加入CoCl2(300 μmol/L)、CQ(30 μmol/L)、CoCl2+CQ處理24 h。使用Trizol法提取細(xì)胞總mRNA。分別1 μg mRNA取用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系為20 μl，其中SYBR Ex Taq 10 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 7.2 μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火、延伸 20 s，反應(yīng)40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析目的基因Beclin1、LC3b、Atg5和Atg7的相對表達量。引物序列見表1。

1.2.2Western blot法檢測RGC-5中的蛋白表達 RGC-5以5×105個/孔接種于6孔板中，處理方法同1.2.1。使用RIPA裂解液于冰上裂解細(xì)胞30 min，12 000 g離心10 min后，取上清液進行蛋白定量。按每個泳道10 μg蛋白上樣量，取一定量蛋白液，加入5×Loading buffer，100℃加熱10 min使蛋白變性。電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5% BSA封閉2 h，分別加入LC3B、Caspase-3和β-actin一抗(1∶2 000)，4℃過夜孵育。用TBST洗膜后加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h后顯影。

1.2.3流式檢測細(xì)胞凋亡 RGC-5細(xì)胞按3×105個/孔接種于6孔板中，處理方法同1.2.1。收集孔板中貼壁和懸浮的細(xì)胞，1 000 g離心5 min，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。取1×105個重懸的細(xì)胞，1 000 g、離心5 min。加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI輕輕混勻。室溫避光孵育15 min后置于冰浴中，1 h內(nèi)用Beckman CytoFlex流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1CoCl2能夠增加RGC-5自噬、誘導(dǎo)其凋亡 CoCl2能夠誘導(dǎo)細(xì)胞慢性缺氧損傷而發(fā)生凋亡。實驗結(jié)果顯示，用300 μmol/L的CoCl2處理后，RGC-5細(xì)胞中自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3b、Atg5及Atg7等均有顯著上調(diào)(圖1、表2)。Western blot結(jié)果也表明，經(jīng)CoCl2處理后，細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3和凋亡相關(guān)蛋白Capase-3表達量也有明顯升高(圖2)。流式結(jié)果表明，CoCl2處理后RGC-5細(xì)胞的早期凋亡比例、晚期凋亡比例及總凋亡比例顯著升高(圖3)。細(xì)胞存活實驗結(jié)果也顯示，CoCl2處理后的RGC-5細(xì)胞存活率明顯下降(圖4)。說明CoCl2誘導(dǎo)細(xì)胞慢性缺氧損傷，導(dǎo)致RGC-5自噬水平增強，細(xì)胞凋亡增多。

圖1 qPCR檢測自噬基因相對表達量Fig.1 Relative expression of autophagy related genes detected by qPCRNote:*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

2.2CQ抑制RGC-5自噬 作為常用的自噬抑制劑，CQ處理后RGC-5細(xì)胞的自噬水平明顯被抑制。qPCR的結(jié)果顯示，相比于對照組，CQ處理后的RGC-5細(xì)胞中Beclin1、LC3b、Atg5及Atg7等自噬相關(guān)基因的表達被明顯抑制(圖1、表2)。Western blot的結(jié)果同樣顯示，RGC-5細(xì)胞里L(fēng)C3B蛋白表達量顯著降低(圖2)。

2.3CQ抑制CoCl2導(dǎo)致的自噬保護RGC-5細(xì)胞 經(jīng)CQ處理后，細(xì)胞自噬相關(guān)基因明顯下調(diào)。與CoCl2組相比，CoCl2聯(lián)合CQ處理組的Beclin1、LC3b、Atg5及Atg7 mRNA表達量顯著下降(圖1、表2)，同時LC3b蛋白量也明顯下調(diào)(圖2)，說明在CQ作用下，CoCl2導(dǎo)致的RGC-5的自噬受到了明顯抑制。進一步的實驗顯示，CQ抑制CoCl2導(dǎo)致的自噬的同時，能夠減少細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達，流式結(jié)果表明細(xì)胞凋亡比例明顯下降，而MTT結(jié)果也證實CQ提高了細(xì)胞在CoCl2中的存活率(表3)。

表2 qPCR檢測自噬基因相對表達量

圖2 Western blot檢測自噬蛋白LC3B和凋亡蛋白Caspase-3的表達Fig.2 Expression of autophagy-related protein LC3B and apoptotic protein Caspase-3 detected by Western blot

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Cell apoptosis detected by flow cytometryNote:A-D.Flow cytometry images of control group，CoCl2 group，CQ group and CoCl2 combined with CQ group;E-G.Early apoptotic ratio，late apoptotic ratio and total apoptotic ratio of cells in each group after treatment.***.P<0.001.

圖4 MTT法檢測細(xì)胞存活率Fig.4 Cell viability detected by MTTNote:*.P<0.05;***.P<0.001.

表3 細(xì)胞凋亡及存活比例

3 討論

青光眼是全球主要的不可逆性致盲眼病之一，是以視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維缺失、視神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能退化為特征的多因子視神經(jīng)疾病[11]。青光眼病理基礎(chǔ)是RGCs的進行性凋亡及視神經(jīng)纖維的丟失，RGCs的死亡引起視功能不可逆損害的發(fā)生[12]。對于青光眼的深入研究發(fā)現(xiàn)，青光眼是一種多類型的疾病群，目前的主要治療方法是降低眼壓[11]。高眼壓導(dǎo)致眼球血流的調(diào)節(jié)異常、視神經(jīng)血流灌注不足，從而引起視網(wǎng)膜微血管的缺血缺氧，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[1]。CoCl2作用下，細(xì)胞內(nèi)Fe2+被置換，使HIF-1α無法羥基化而在胞內(nèi)聚集，胞質(zhì)中大量HIF-1α堆積，會發(fā)生去磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。因此，CoCl2處理RGC-5能夠有效模擬視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞病理性凋亡。

高眼壓或者視神經(jīng)血流灌注不足導(dǎo)致的缺血缺氧等，會引起RGCs的凋亡[14]。細(xì)胞凋亡是一個高度管理化、程序化使細(xì)胞死亡和淘汰的過程，是機體調(diào)控發(fā)育、控制細(xì)胞衰老、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機制[15]。多項研究表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡過度會導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性病變，而RGCs凋亡在視神經(jīng)炎、青光眼等多種疾病中存在很大影響，會導(dǎo)致多種視功能失能[16]。細(xì)胞凋亡主要可分為3個階段[15]：首先，細(xì)胞間接觸消失，細(xì)胞膜仍保持完整尚未失去通透性，細(xì)胞質(zhì)中的核糖體從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫落，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與質(zhì)膜融合，染色體固縮；然后，染色質(zhì)斷裂后與線粒體等細(xì)胞器聚集在一起，被內(nèi)折的細(xì)胞膜包圍，逐漸分隔形成單個凋亡小體；最后，凋亡小體逐步被臨近細(xì)胞吞噬消化。凋亡效應(yīng)分子Caspase-3位于凋亡通路樞紐位置，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，是細(xì)胞進入程序性死亡的特異性標(biāo)志[17]。本研究結(jié)果顯示，CoCl2處理后的RGC-5的Caspase-3蛋白表達量明顯升高，說明細(xì)胞凋亡啟動。流式細(xì)胞術(shù)和MTT的結(jié)果也表明，細(xì)胞Caspase-3表達升高，細(xì)胞凋亡比例增加，細(xì)胞存活比例下降。

自噬作為除凋亡外的另一種細(xì)胞程序性死亡形式，是細(xì)胞在自噬小體和溶酶體的共同作用下，將細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器或者錯誤折疊蛋白進行回收再利用的過程[7]。其發(fā)生過程大致如下：①在相關(guān)刺激條件下，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成分隔膜，包圍在被降解物周圍；②分隔膜不斷延伸，包裹要降解的組分，形成自噬體；③自噬體轉(zhuǎn)運至溶酶體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，自身降解，自噬體膜脫落后循環(huán)再利用[18]。自噬體膜上的LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化成LC3-Ⅱ是自噬體膜形成的關(guān)鍵步驟，也是細(xì)胞自噬啟動的重要標(biāo)志之一[19]。自噬在包括青光眼等神經(jīng)退行性疾病中起到重要作用[9]。本研究結(jié)果顯示：與對照組相比，CoCl2處理組細(xì)胞的LC3蛋白表達水平增加，而CoCl2聯(lián)合CQ處理后，LC3表達水平下降。

細(xì)胞自噬和凋亡共同受到一些轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的調(diào)控，包括mTOR、NF-κB、p53、PI3K/AKT及JNK等[20]。有研究表明，自噬與凋亡存在著緊密聯(lián)系，自噬會抑制、促進或者伴隨凋亡發(fā)生[5，21-24]。有研究顯示，在人胚腎細(xì)胞HEK293，低濃度鎘可能通過ERK1/2和AKT蛋白引起細(xì)胞自噬，同時引發(fā)細(xì)胞凋亡[25]。但在使用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后，細(xì)胞自噬在一定范圍內(nèi)抑制了凋亡。而在本研究中，CoCl2導(dǎo)致RGCs自噬增強，促進了其凋亡。但在不同的細(xì)胞或者疾病模型中，結(jié)果可能不盡相同。因此，自噬和凋亡之間的關(guān)系還需要更進一步的研究。

CQ作為一種廣泛用于治療瘧疾、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的抗炎藥，本身具有弱堿性，同時具有趨向溶酶體特性[26]。CQ選擇性進入溶酶體后，會破壞溶酶體的pH，影響磷脂酶A2、單?；视椭久傅鹊幕钚裕棺允尚◇w包裹的受損細(xì)胞器、錯誤折疊蛋白等不能被溶酶體有效降解，導(dǎo)致自噬小體在細(xì)胞內(nèi)的大量累積，從而抑制細(xì)胞自噬。本研究探究了氯喹對CoCl2處理的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護作用，結(jié)果顯示，相對于CoCl2組而言，CoCl2聯(lián)合氯喹組，能夠有效抑制CoCl2導(dǎo)致的自噬相關(guān)基因、蛋白的表達，下調(diào)細(xì)胞的自噬水平，同時能夠下調(diào)Caspase-3等凋亡蛋白的表達，減弱CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，有效保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。