張海萍 袁 梅 彭 慧

(南華大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，衡陽 421000)

血管平滑肌細胞具有維持血管正常生理功能的作用，廣泛參與一系列腦血管疾病的進展，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]。因此深入研究血管平滑肌細胞生物學行為及其調(diào)控機制為心腦血管疾病的防治提供新方向和新靶點意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與血管形成、血管衰老、心肌肥大、動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病相關，在心血管疾病治療中起重要作用，可作為該類疾病診斷的生物標記物與治療靶點[2]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-124可抑制血管平滑肌細胞增殖[3]；miR-124還可減弱人主動脈血管平滑肌細胞增殖和表型轉換[4]。同型半胱氨酸誘導的動脈粥樣硬化中miR-124表達水平明顯降低[5]。研究發(fā)現(xiàn)WNT1誘導信號通路蛋白1(WNT1-induced signaling pathway protein 1，WISP1)具有調(diào)節(jié)增殖、遷移的功能，在血管生成、炎癥、創(chuàng)傷修復和腫瘤發(fā)生過程中起重要作用[6]。過表達WISP1能夠促進人胸主動脈血管平滑肌的增殖及遷移[7]。WISP1可降低過氧化氫誘導的血管平滑肌細胞凋亡[8]。然而miR-124-3p對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及其機制尚不清楚，本實驗旨在研究miR-124-3p對TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移、侵襲影響及其機制是否與WISP1有關,為血管平滑肌細胞引起的相關心血管疾病的防治提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；TNF-α購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；二甲基亞砜(DMSO)、RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、PBS緩沖液購自Sigma公司；抗體購自上海煊翎生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購于美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。miR-NC、miR-124-3p、anti-miR-NC、anti-miR-124-3p、si-NC、si-WISP1、pcDNA、pcDNA-WISP1、WT-WISP1、MUT-WISP1質(zhì)粒購自北京源生思創(chuàng)生物科技有限公司。Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司；FACS caliber流式細胞儀、PowerPac蛋白電泳儀及Gel Doc XR+凝膠顯示系統(tǒng)購自美國BD公司;熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1分離培養(yǎng)大鼠腦動脈血管平滑肌細胞 取購自上海斯萊克實驗動物中心雄性SD大鼠2～3只，將大鼠麻醉后處死，迅速取出整腦，在解剖顯微鏡下分離大腦基底動脈，剪碎后置于細胞培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待組織塊與瓶底黏附后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉平放，繼續(xù)培養(yǎng)3 d可見細胞爬出，換液后繼續(xù)培養(yǎng)10 d,組織塊周圍細胞融合度達80%左右時，進行傳代，取培養(yǎng)3代后細胞用于實驗。

1.2.2細胞處理與分組 取對數(shù)生長期細胞無血清培養(yǎng)12 h后加入100 ng/ml的TNF-α作為TNF-α組，正常培養(yǎng)的細胞作為對照組(Con)；將miR-NC、miR-124-3p、anti-miR-NC、anti-miR-124-3p轉染至大鼠腦基底動脈血管平滑肌細胞中，分別記為miR-NC組、miR-124-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-124-3p組；將miR-NC、miR-124-3p、si-NC、si-WISP1轉染至大鼠腦基底動脈血管平滑肌細胞后再用100 ng/ml的TNF-α處理，記為TNF-α+miR-NC組、TNF-α+miR-124-3p組、TNF-α+si-NC組、TNF-α+si-WISP1組；將miR-124-3p分別與pcDNA、pcDNA-WISP1共轉染至大鼠腦基底動脈血管平滑肌細胞后再用100 ng/ml 的TNF-α處理，記為TNF-α+miR-124-3p+pcDNA組、TNF-α+miR-124-3p+pcDNA-WISP1組。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測miR-124-3p和WISP1 mRNA表達水平 細胞培養(yǎng)48 h后提取RNA，反轉錄成cDNA，按照試劑盒說明進行PCR，每個樣品設3個重復，反應條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量用2-ΔΔCt法計算。miR-124-3p和WISP1分別以U6和β-actin為內(nèi)參進行PCR擴增，miR-124-3p上游引物序列：5′-GCTTAAGGCACGC-GGT-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCGGAGGT-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。WISP1上游引物序列：5′-AGGTATGGCAGAGGTGCAAG-3′，下游引物序列：5′-GTGTGTGTAGGCAGGGAGTG-3′；β-actin上游引物序列：5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′，下游引物序列：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。

1.2.4Western blot檢測WISP1、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9表達水平 細胞培養(yǎng)48 h后提取細胞總蛋白，用BCA試劑盒定量后將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉至PVDF，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗滌；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育90 min，TBST洗滌，用ECL發(fā)光液顯影，成像后用Quantity One凝膠分析軟件測定各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個蛋白樣品設3個復孔。

1.2.5MTT檢測細胞活性 各組細胞培養(yǎng)至48 h時加入20 μl MTT溶液，37℃孵育4 h；棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO后振蕩反應10 min，在490 nm 波長條件下用酶標儀檢測各孔吸光度(OD)值。細胞活性(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.2.6Transwell檢測細胞遷移和侵襲 各組細胞培養(yǎng)48 h后用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整濃度為1×105個/ml。①細胞遷移實驗：取200 μl細胞懸液接種于Transwell小室上室中，下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后取出小室，吸去培養(yǎng)液后用棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS洗滌，4 %多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡拍照并計數(shù)。②細胞侵襲實驗：以1∶6比例加入DMEM培養(yǎng)液稀釋Matrigel后，包被Transwell小室的上室，室溫下干燥凝固后，按照細胞遷移實驗步驟操作。最后顯微鏡下觀察結晶紫染色細胞數(shù)即為侵襲細胞數(shù)。

1.2.7熒光素酶報告實驗檢測miR-124-3p對WISP1的靶向調(diào)控 構建含有miR-124-3p結合位點的WISP1-3 UTR野生型及突變型報告基因載體，將miR-NC、miR-124-3p與野生型及突變型報告基因載體共轉染至大鼠腦基底動脈血管平滑肌細胞中。按照說明書檢測熒光素酶活性，實驗重復3次。

2 結果

2.1miR-124-3p和WISP1在TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞中的表達 與對照組相比，TNF-α組miR-124-3p表達水平顯著降低，WISP1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

2.2miR-124-3p過表達對TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖的影響 與對照組相比，TNF-α組miR-124-3p表達水平顯著降低，細胞活性顯著升高，CyclinD1表達水平顯著升高，p21表達水平顯著降低(P<0.05)；與TNF-α+miR-NC組相比，TNF-α+miR-124-3p組miR-124-3p表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，CyclinD1表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1、表2。

2.3miR-124-3p過表達對TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞遷移侵襲的影響 與對照組相比，TNF-α組細胞遷移、侵襲數(shù)顯著升高，MMP-2、MMP-9表達水平顯著升高(P<0.05)；與TNF-α+miR-NC組相比，TNF-α+miR-124-3p組細胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖2、表3。

表1 miR-124-3p和WISP1在TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞中的表達

圖1 增殖相關蛋白的表達Fig.1 Expressions of proliferation-related proteins

圖2 遷移侵襲相關蛋白的表達Fig.2 Expressions of migration-invasive related proteins

表2 miR-124-3p過表達對TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖的影響

表3 miR-124-3p過表達對TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞遷移侵襲的影響

2.4干擾WISP1表達對TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移侵襲的影響 與對照組相比，TNF-α組WISP1表達水平顯著升高，細胞活性顯著升高，遷移、侵襲數(shù)顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著升高，p21表達水平顯著降低(P<0.05)；與TNF-α+si-NC組相比，TNF-α+si-WISP1組WISP1表達水平顯著降低，細胞活性顯著降低，細胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖3、表4。

2.5miR-124-3p靶向調(diào)控WISP1的表達 Starbase預測WISP1與miR-124-3p存在結合位點(圖4A)。熒光素酶報告實驗結果顯示，相較于miR-NC組，miR-124-3p組轉染野生型WISP1(WT-WISP1)表達載體的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05，表5)；而轉染突變型WISP1(MUT-WISP1)表達載體的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞的熒光素酶活性差異不顯著。Western blot檢測結果顯示，相較于miR-NC組，miR-124-3p組WISP1表達水平顯著降低；相較于anti-miR-NC組，anti-miR-124-3p組WISP1表達水平顯著升高(P<0.05，圖4B、表6)。可見，miR-124-3p可靶向調(diào)控WISP1的表達。

2.6WISP1過表達逆轉miR-124-3p過表達對TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移侵襲的作用 與TNF-α+miR-124-3p+pcDNA組相比，TNF-α+miR-124-3p+pcDNA-WISP1組大鼠腦動脈血管平滑肌細胞中WISP1表達水平顯著升高，細胞活性顯著升高，遷移、侵襲數(shù)顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著升高，p21表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖5、表7。

圖3 WISP1和增殖、遷移侵襲相關蛋白的表達Fig.3 Expressions of WISP1 and proliferation,migration and invasion-associated proteins

圖4 miR-124-3p靶向調(diào)控WISP1的表達Fig.4 miR-124-3p targeted regulation of WISP1 expressionNote:A.3′UTR sequence of WISP1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-124-3p;B.WISP1 protein expression.

表4 干擾WISP1表達對TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移侵襲的影響

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 miR-124-3p調(diào)控WISP1蛋白的表達

表7 WISP1過表達逆轉miR-124-3p過表達對TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移侵襲的作用

圖5 WISP1和增殖、遷移侵襲相關蛋白的表達Fig.5 Expressions of WISP1 and proliferation,migration and invasion-associated proteins

3 討論

血管平滑肌細胞是血管壁的主要成分，其異常增殖和遷移是動脈粥樣硬化、腦梗死、血管形成術后再狹窄等心腦血管疾病病變的基礎[9]。研究顯示miRNA參與了血管平滑肌細胞增殖和遷移[10]。miR-124可消除氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細胞凋亡[11]。miR-124-3p還可抑制動脈粥樣硬化斑塊中的膠原蛋白合成[12]。miR-124-3p能抑制血小板衍生生長因子(PDGF)-BB誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移[13]。本實驗結果顯示，過表達miR-124-3p后，TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞中細胞活性顯著降低，遷移、侵襲數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高，說明過表達miR-124-3p可抑制TNF-α誘導的血管平滑肌細胞異常增殖、遷移和侵襲，表明miR-124-3p可能與血管相關疾病有關。

有研究報道WISP1對假性動脈瘤APOE-/-敲除小鼠的動脈粥樣硬化和脆弱性具有保護作用[14]。沉默WISP1減少小鼠主動脈平滑肌細胞的遷移[15]。本實驗結果顯示，TNF-α處理的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞中WISP1表達水平顯著升高，干擾WISP1表達，細胞活性顯著降低，遷移、侵襲數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，p21表達水平顯著升高，說明干擾WISP1表達可抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移和侵襲。且本實驗還發(fā)現(xiàn)miR-124-3p靶向調(diào)控WISP1，WISP1過表達逆轉了miR-124-3p過表達對TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-124-3p可抑制TNF-α誘導的大鼠腦動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與下調(diào)WISP1有關，可為相關心血管疾病的防治提供新靶點和理論依據(jù)。