鄭顯良 姚中吉

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院輸血科，?？?570311)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以持續(xù)性滑膜炎為主要病理特征的慢性系統(tǒng)性自身免疫疾病，致殘率較高。我國(guó)RA患病率約為0.42%，略高于國(guó)外報(bào)道的發(fā)展中國(guó)家的0.35%，其中女性發(fā)病率約為男性的3倍[1-3]。據(jù)報(bào)道，RA 50%的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)歸因于遺傳因素[4]。RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種免疫細(xì)胞的激活和炎癥因子的表達(dá)在RA的發(fā)病過(guò)程中起重要作用[5]。酪氨酸激酶2(TYK2)是JAKs家族成員，可與STATs結(jié)合啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯，促進(jìn)炎癥因子釋放[6]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于TYK2基因在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過(guò)敏性哮喘、銀屑病等免疫性疾病的作用已開(kāi)展相關(guān)研究，而其在RA中的研究鮮有報(bào)道[7-9]。因此，本研究探討TYK2 mRNA在RA患者中的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)RA患者外周血清RA標(biāo)志物、炎癥因子及骨代謝指標(biāo)水平，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析，明確TYK2基因在RA的作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1資料 選擇2017年6月～2018年10月于我院就診的RA患者55例，其中男性13例，女性42例，年齡23～67歲，病情活動(dòng)指標(biāo)簡(jiǎn)化疾病活動(dòng)指數(shù)(SDAI)評(píng)分7.5～43分，平均(22.34±9.23)分。所有RA患者均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟制定的分類標(biāo)準(zhǔn)。健康志愿者50例作為對(duì)照，其中男性12例、女性38例，年齡25～60歲，兩組性別、年齡具有可比性。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象或家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1外周血單核細(xì)胞分選 EDTA抗凝管抽取RA患者及健康志愿者外周血5 ml，利用人全血單核細(xì)胞分離液進(jìn)行分選，血細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及單核細(xì)胞純度檢測(cè)。

1.2.2一般指標(biāo)檢測(cè) 分別采集RA患者和健康志愿者外周血3 ml，檢測(cè)RF、抗CCP水平，ELISA檢測(cè)IL-2、IL-17、IL-21、OST、25(OH)D、β-CTX、T-P1NP水平。

1.2.3TYK2基因檢測(cè) 采用RT-PCR法測(cè)定RA患者和健康志愿者外周血單核細(xì)胞中TYK2基因。TRIzol試劑盒提取樣本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用SYBR Green相對(duì)定量法進(jìn)行定量檢測(cè)。引物序列：TYK2 F：5′-GGAGGAGGGTTCTAGTGGCA-3′，R：5′-ATGTCCCGGAAGTCACAG-AAG-3′；GAPDH F：5′-ACAACTTTGGTATCGTG-GAAGG-3′，R：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，35～40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。2-ΔΔCt法定量分析。

2 結(jié)果

2.1RA患者和健康志愿者臨床數(shù)據(jù)比較 50例RA患者外周血清中RF[(129.86±44.10)IU/ml]和抗CCP滴度[(90.17±19.33)RU/ml]顯著高于55例健康志愿者外周血清中RF[(4.35±2.29)IU/ml]和抗CCP滴度[(21.27±5.82)RU/ml](P<0.01)。

2.2RA患者和健康志愿者外周血清炎癥因子水平 RA患者血清炎癥因子IL-2、IL-17、IL-21水平較健康志愿者明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2.3RA患者和健康志愿者骨代謝指標(biāo)比較 RA患者血清OST、25(OH)D、T-P1NP等骨代謝指標(biāo)水平較健康志愿者均明顯下降，β-CTX水平明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.4RA患者和健康志愿者外周血單核細(xì)胞TYK2 mRNA表達(dá)比較 與健康志愿者(1.60±0.42)相比，RA患者單核細(xì)胞TYK2 mRNA表達(dá)(4.93±0.90)顯著升高(P<0.01)。

2.5TYK2 mRNA與患者SDAI評(píng)分的相關(guān)性分析 RA患者單核細(xì)胞TYK2 mRNA表達(dá)與SDAI評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.339 2，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

表1 RA患者與健康志愿者血清骨代謝指標(biāo)比較

圖1 RA患者與健康志愿者血清炎癥因子水平Fig.1 Levels of serum inflammatory factors between RA patients and healthy volunteers

圖2 RA患者TYK2 mRNA與SDAI評(píng)分相關(guān)性分析Fig.2 Correlation between TYK2 mRNA and SDAI score of RA patients

圖3 TYK2 mRNA與血清RF、抗CCP滴度的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation between TYK2 mRNA and serum RF，anti-CCP

圖4 TYK2 mRNA與血清IL-2、IL-17和IL-21水平相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between TYK2 mRNA and serum IL-2，IL-17，IL-21

圖5 TYK2 mRNA與血清OST、25(OH)D、β-CTX及T-P1NP水平相關(guān)性分析Fig.5 Correlation between TYK2 mRNA and serum OST，25(OH)D，β-CTX，T-P1NP

2.6TYK2 mRNA與RA標(biāo)志物RF和抗CCP相關(guān)性分析 RA患者單核細(xì)胞TYK2 mRNA表達(dá)與其血清RF和抗CCP滴度均呈正相關(guān)(r=0.634 1、0.374 7，P<0.01或P<0.000 1)，見(jiàn)圖3。

2.7TYK2 mRNA與血清IL-2、IL-17和IL-21的相關(guān)性分析 RA患者單核細(xì)胞TYK2 mRNA表達(dá)與其血清IL-2、IL-17及IL-21水平均呈正相關(guān)(r=0.457 4、0.404 2、0.278 9，P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.8TYK2 mRNA與骨代謝指標(biāo)相關(guān)性分析 RA患者單核細(xì)胞TYK2 mRNA表達(dá)與其血清OST、25(OH)D及T-P1NP水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.398 7、-0.430 4、-0.484 4，P<0.01)，與β-CTX呈正相關(guān)(r=0.324 3，P<0.05)，見(jiàn)圖5。

3 討論

酪氨酸激酶2(TYK2)是JAK激酶家族成員，該家族成員還包括JAK1、JAK2和JAK3，JAK激酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子引起的炎癥方面起重要作用[10]。據(jù)報(bào)道，TYK2基因的多態(tài)性能夠不同程度地引起細(xì)胞炎癥因子應(yīng)答，引發(fā)自身免疫系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致各種自身免疫性疾病[11,12]。本文對(duì)從50例健康志愿者和55例RA患者外周血分選的單核細(xì)胞進(jìn)行了TYK2基因表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果表明，與健康志愿者相比，RA患者外周血單核細(xì)胞TYK2 mRNA表達(dá)顯著升高。RA患者TYK2 mRNA表達(dá)與其SDAI評(píng)分呈正相關(guān)。

RF在RA患者體內(nèi)出現(xiàn)最早，與RA存在顯著相關(guān)性，RF滴度越高，表明患者的病情越重，預(yù)后越差[13]。但RF的特異性不高，除在RA患者血清中表達(dá)外，在傳染病、肝功能障礙、惡性腫瘤及結(jié)締組織患者中也有表達(dá)[14]。近年研究發(fā)現(xiàn)，RA的病情進(jìn)程與瓜氨酸相關(guān)抗體的產(chǎn)生與沉積聯(lián)系密切，其中以抗CCP最具代表性[15]。研究表明，抗CCP在早期RA診斷中具有較高的靈敏度和特異性。葛君琍等[16]檢測(cè)了117例RA患者血清中抗CCP滴度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其靈敏度為82.4%、特異性為93.5%。目前臨床常采用兩者聯(lián)合檢測(cè)法進(jìn)行RA早期診斷。本研究檢測(cè)了55例RA患者血清中RF和抗CCP滴度，并將其與TYK2 mRNA表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明，TYK2基因表達(dá)與患者血清RF和抗CCP呈顯著正相關(guān)，提示TYK2基因與RA病理進(jìn)程相關(guān)。

為進(jìn)一步考察TYK2基因與RA的關(guān)系，本文檢測(cè)了RA相關(guān)炎癥因子IL-2、IL-17及IL-21水平。IL-2又稱T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)T細(xì)胞增生并促進(jìn)免疫反應(yīng)，引起局部慢性炎癥和基質(zhì)破壞[17]。IL-17為T(mén)細(xì)胞源的促炎因子，主要由記憶型T細(xì)胞產(chǎn)生[18]。研究表明，在RA患者滑膜中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)IL-17，IL-17的存在極大提高了滑膜細(xì)胞中MMP-1水平，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞損傷[19]。此外，IL-17還可通過(guò)PI3K/AKT和NF-κB通路增強(qiáng)自身表達(dá)，并促進(jìn)IL-6、IL-8和TNF-α分泌，加重患處炎癥程度[20]。IL-21是由CD4+T分泌的促炎細(xì)胞因子，與IL-21受體結(jié)合后通過(guò)自分泌的方式介導(dǎo)其本身的分泌，并上調(diào)Th1免疫反應(yīng)的相關(guān)炎癥因子，研究證實(shí)，IL-21參與RA發(fā)病過(guò)程，并與病情進(jìn)展高度相關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清中IL-2、IL-17和IL-21水平較健康志愿者顯著升高。TYK2作為JAKs激酶家族的重要成員，參與多種炎癥因子表達(dá)，TYK2 mRNA與此3種細(xì)胞因子均呈顯著正相關(guān)，表明TYK2參與RA的發(fā)生發(fā)展。

RA患者常出現(xiàn)慢性、反復(fù)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退化甚至骨壞死，同時(shí)出現(xiàn)繼發(fā)性骨質(zhì)疏松等骨代謝相關(guān)癥狀[4]。本研究檢測(cè)了RA患者血清骨代謝指標(biāo)水平，發(fā)現(xiàn)RA患者血清OST、25(OH)D、T-P1NP水平均顯著下降，β-CTX水平顯著升高。相關(guān)性分析表明TYK2基因與OST、25(OH)D、T-P1NP呈顯著負(fù)相關(guān)，與β-CTX呈顯著正相關(guān)。

綜上所述，本研究初步分析了TYK2基因在RA患者中的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)了血清RA標(biāo)志物、炎癥因子及骨代謝指標(biāo)水平，并進(jìn)一步分析了TYK2基因表達(dá)與檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果表明，TYK2基因的表達(dá)與RA病情進(jìn)展密切相關(guān)，其可能通過(guò)調(diào)控與其相關(guān)的IL-2、IL-17和IL-21水平參與疾病發(fā)展。針對(duì)TYK2基因的靶向治療可阻斷早期炎癥損傷，對(duì)于RA的預(yù)測(cè)、治療和預(yù)后具有重要價(jià)值。