周 琦 丁麗麗 李 芬 劉愛國 周學(xué)鋒 楊 燕

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，武漢 430000)

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞受到外界壓力時細(xì)胞周期進(jìn)入長久停滯的狀態(tài)。細(xì)胞衰老可分為復(fù)制性衰老與治療誘導(dǎo)性衰老(therapy-induced senescence，TIS)[1]。復(fù)制性衰老是對DNA損傷、癌基因激活、端粒縮短等的應(yīng)急反應(yīng)，是阻止腫瘤發(fā)生的一種自我保護(hù)機(jī)制。TIS是指放療、化療或藥物靶向治療引起的腫瘤細(xì)胞衰老，其可由治療導(dǎo)致的DNA損傷或抑制細(xì)胞分裂必需的激酶(如極光激酶aurora kinase,AURKA)引起[2]。TIS因其能使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入生長靜止期且其藥物毒性遠(yuǎn)低于細(xì)胞凋亡而倍受關(guān)注。早期研究在肺癌、乳腺癌中觀察到化療誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老與治療應(yīng)答正相關(guān)[3，4]。衰老的腫瘤細(xì)胞停止分裂，腫瘤進(jìn)展得到控制。近期研究表明化療誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老是一把“雙刃劍”：一方面衰老細(xì)胞周期阻滯可有效控制腫瘤生長；另一方面衰老細(xì)胞并沒有死亡，其可自分泌或旁分泌生長因子、細(xì)胞因子及蛋白酶等，這種現(xiàn)象稱為衰老相關(guān)的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)。SASP 可使衰老的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)成促炎細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)周邊非衰老腫瘤細(xì)胞生長、復(fù)發(fā)[5,6]。衰老細(xì)胞可分泌胞外囊泡(EVs)，其分泌的EVs能夠調(diào)節(jié)受體細(xì)胞表型，如加速衰老、炎癥、干細(xì)胞失能與癌癥進(jìn)展，功能類似于SASP，因此認(rèn)為衰老相關(guān)EVs(senescence-associated EVs，SAEs)是一類新的SASP因子[7]。為了解SAEs對腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞的影響，本文利用AURKA抑制劑MLN8237處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR32建立細(xì)胞衰老模型，收集培養(yǎng)上清中衰老細(xì)胞分泌的EVs(SAEs)，分別觀察SAEs對IMR32細(xì)胞與單核細(xì)胞THP-1的影響，初步判斷SAEs是否影響腫瘤微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞，為進(jìn)一步探討SAEs對腫瘤微環(huán)境的影響及其機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 化療藥物阿霉素、順鉑及AURKA抑制劑 MLN8237購自MCE公司；RIPA細(xì)胞裂解液購自武漢生命公司；蛋白酶抑制劑購自Roche公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司；衰老相關(guān)β-gal染色試劑盒購自GENEMED科技公司；AURKA、 pAURKA、GAPDH、 TSG101、 GRP78、 β-actin、C-MYC、N-MYC及BRD4抗體購自Arigo公司；Rb及p-Rb抗體購自Arigo公司；PI與RNaseA購自谷歌公司；定量RT-PCR試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)與TB Green?Fast qPCR Mix試劑盒購自TaKaRa公司；外泌體分離試劑盒Exoquick購自廣州銳博生物公司。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR32、SK-N-SH、SK-N-BE2及單核細(xì)胞系THP-1購自ATCC；DMEM、MEM、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco；化學(xué)發(fā)光顯色試劑、2-硫基乙醇、DMSO、肉豆蔻酸佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)購自Sigma公司；TRIzol購自Invitrogen。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) IMR32與SK-N-SH 用含10%胎牛血清、100 μg/ml青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱；SK-N-BE2培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM/F12；THP-1用含10%胎牛血清、0.05 mmol/L 2-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)期用于實驗。

1.2.2細(xì)胞周期檢測 細(xì)胞(IMR32、SK-N-SH、SK-N-BE2)以3×105個/孔接種于6孔板，第2天分別加入0.5 μmol/L阿霉毒(Doxorubicin)、0.5 μmol/L順鉑(Cisplatin)及0.5 μmol/L MLN8237處理72 h，以不加藥的培養(yǎng)基(Medium)或DMSO為對照組。胰酶消化后，加入冷無水乙醇，-20℃固定1 h。將固定好的細(xì)胞離心棄無水乙醇，冷PBS洗2次。加入RNaseA溶液，37℃水浴30 min。加入PI染色液，充分混勻后4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性檢測 IMR32細(xì)胞以3×105個/孔接種于6孔板，第2天加入0.5 μmol/L MLN8237處理72 h，設(shè)置未經(jīng)藥物處理的正常對照組。按照SA-β-gal染色試劑盒說明書染色細(xì)胞，37℃孵育16 h，鏡下觀察藍(lán)染細(xì)胞并拍照。

1.2.4EVs收集與鑒定 將含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基以170 000 g、4℃超速離心2 h后棄去血清中EVs，收集上清，0.22 μm過濾后備用。IMR32細(xì)胞用上述含EVs-free血清的DMEM培養(yǎng)至對數(shù)生長期，0.5 μmol/L MLN8237處理72 h后收集上清，分別用超速離心技術(shù)或PEG技術(shù)分離EVs。超速離心技術(shù)：2 000 g離心10 min，10 000 g 4℃離心30 min棄去細(xì)胞碎片，4℃ 170 000 g離心2 h，所得沉淀用PBS重懸，保存?zhèn)溆?。利用PEG技術(shù)根據(jù)Exoquick試劑盒說明書分離EVs。Western blot檢測兩種方法得到的EVs后選取超速離心得到的EVs送至廣州表觀生物技術(shù)公司分析囊泡粒徑與濃度。

1.2.5Western blot分析EVs對腫瘤細(xì)胞影響 收集處理好的細(xì)胞或EVs樣本，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解，提取總蛋白，蛋白經(jīng)BCA法定量?？偟鞍鬃冃院竺靠咨蠘?0 μg行SDS-PAGE電泳分離。凝膠經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液平衡后，將蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜。所用一抗使用濃度分別為：AURKA(1∶2 000)，pAURKA(1∶1 000)，GAPDH(1∶5 000)，TSG101(1∶1 000)，GRP78(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)，C-MYC(1∶1 000)，N-MYC(1∶1 000)，BRD4(1∶1 000)。TBST漂洗后加二抗(1∶10 000)，37℃孵育1 h。NC膜浸泡于等量ECL發(fā)光試劑A、B混合液數(shù)秒，于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.2.6顯微成像及RT-qPCR分析EVs對巨噬細(xì)胞的影響 THP-1細(xì)胞接種至6孔板培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別加入SAEs(SAEs組)、腫瘤細(xì)胞來源EVs(EVs組)，以不加EVs為陰性對照(Non-treated組)，PMA處理組(PMA組)為陽性對照。培養(yǎng)96 h后收集細(xì)胞，顯微觀察并成像記錄細(xì)胞形態(tài)；TRIzol法提取mRNA。逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；各基因定量PCR采用TB Green?Fast qPCR Mix試劑盒完成。引物序列見表1。PCR程序如下：95℃變性2 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s;72℃ 10 s,共40個循環(huán)；72℃延伸1 min。以GAPDH作為內(nèi)參，各目的基因mRNA水平用2-ΔΔCt表示。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞衰老模型建立 3種藥物中，MLN8237誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯最明顯；阻滯于G2/M期的IMR32細(xì)胞比例最高，達(dá)87.4%。阿霉素作用神經(jīng)母細(xì)胞瘤導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯程度最輕，順鉑組細(xì)胞阻滯程度中等(圖1A)。0.5 μmol/L MLN8237可抑制AURKA磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞衰老(圖1B)。通常衰老細(xì)胞形態(tài)變化表現(xiàn)為體積和細(xì)胞核增大、核膜內(nèi)折、細(xì)胞器變形等，同時β-gal活性上調(diào)，底物X-gal在β-半乳糖苷酶催化下生成藍(lán)色產(chǎn)物。圖1C顯示0.5 μmol/L MLN8237處理IMR32細(xì)胞72 h后，與正常組比較，加藥組細(xì)胞呈現(xiàn)大而扁平的衰老狀態(tài)，鏡下所見幾乎所有細(xì)胞均變大且藍(lán)染。因此，選擇MLN8237作用IMR32細(xì)胞建立細(xì)胞衰老模型用于后續(xù)實驗。

表2 EVs顆粒大小與濃度

圖1 細(xì)胞衰老模型的建立Fig.1 Establishment of cell senescence model

圖2 SAEs的分離與鑒定Fig.2 Isolation and identification of SAEs

圖3 SAEs抑制IMR32細(xì)胞BRD4通路Fig.3 SAEs inhibits BRD4 pathway in IMR32 cells

圖4 SAEs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞極化Fig.4 SAEs induced THP-1 cell polarization

圖5 SAEs抑制THP-1細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)Fig.5 SAEs inhibited cytokines expression of THP-1 cellNote:*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

2.2超速離心收集衰老細(xì)胞上清EVs Western blot結(jié)果顯示，兩種方法分離樣本的膜蛋白TSG101在IMR32細(xì)胞及EVs樣品中均有表達(dá)，定位于胞漿的蛋白GRP78及β-actin只在細(xì)胞樣品中檢出，EVs樣品中沒有發(fā)現(xiàn)陽性條帶。超速離心收集的EVs樣品中TSG101含量明顯高于PEG法分離的EVs(圖2A)。衰老細(xì)胞與對照細(xì)胞分泌的EVs平均粒徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但SAEs濃度明顯降低，可能與衰老細(xì)胞停止分裂，細(xì)胞數(shù)目顯著低于對照細(xì)胞有關(guān)(圖2B、表2)。由表2可知SAEs顆粒大小處于30～150 nm的顆粒百分比明顯高于對照組，即SAEs外泌體含量高于對照組。

2.3SAEs抑制IMR32細(xì)胞BRD4通路 與對照EVs相比，SAEs顯著抑制BRD4與C-MYC表達(dá)，對β-catenin、AURKA、N-MYC、Rb及p-Rb表達(dá)影響不顯著。對照EVs明顯上調(diào)C-MYC，對Rb與p-Rb的水平有明顯抑制作用(圖3)。

2.4SAEs影響THP-1細(xì)胞分化狀態(tài) 不同細(xì)胞來源的EVs與單核巨噬細(xì)胞共同孵育96 h后THP-1細(xì)胞形態(tài)如圖4，未處理的陰性對照組細(xì)胞處于正常懸浮狀態(tài)；PMA組細(xì)胞發(fā)生極化，貼壁伸出偽足；兩種EVs處理組細(xì)胞狀態(tài)與PMA處理組相似。RT-qPCR結(jié)果表明，兩種來源EVs均能抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α，且SAEs的抑制效果顯著高于腫瘤細(xì)胞來源EVs；與未處理對照組相比，SAEs顯著抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-10與TGF-β，而腫瘤細(xì)胞來源EVs大幅上調(diào)了這兩種蛋白特別是IL-10表達(dá)；EVs與SAEs對巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β與IL-4的表達(dá)影響均無統(tǒng)計學(xué)差異(圖5)。

3 討論

低濃度化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老是化療控制腫瘤的機(jī)制，細(xì)胞衰老同時伴隨細(xì)胞周期阻滯。本文利用3種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，分析了不同化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯情況。結(jié)果表明不同藥物誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯效果不同，同種藥物作用不同細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的效果也不同。例如臨床常用藥物阿霉素誘導(dǎo)3種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期阻滯效果均不明顯；另一種化療藥物順鉑對SK-N-SH細(xì)胞系幾乎無影響，但能誘導(dǎo)約50%的IMR32細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。三種藥物中，AURKA抑制劑MLN8237效果最明顯，有87.4% IMR32細(xì)胞阻滯于G2/M期。β-半乳糖苷酶染色顯示，幾乎所有鏡下細(xì)胞均藍(lán)染，細(xì)胞大而扁平，呈現(xiàn)典型衰老狀態(tài)。因此，課題組利用MLN8237作用IMR32細(xì)胞建立細(xì)胞衰老模型研究衰老相關(guān)胞外囊泡。

EVs是細(xì)胞主動釋放的納米級膜囊泡,是腫瘤微環(huán)境的重要成分，在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用?；谄渖锇l(fā)生、大小和物理性質(zhì)，可進(jìn)一步分類為外泌體和微泡。其中直徑30～150 nm的顆粒為外泌體。外泌體中含有miRNA、mRNA、DNA片段和蛋白質(zhì)，從供體細(xì)胞穿梭到受體細(xì)胞，是細(xì)胞間信息傳送的重要媒介[8,9]。各種細(xì)胞均可以分泌EVs，盡管經(jīng)化療藥物誘導(dǎo)的SAEs低于未處理細(xì)胞，但外泌體所占百分比高于未處理細(xì)胞，說明細(xì)胞在藥物刺激下，細(xì)胞向外傳遞信息的“包裹”增加。SAEs中具體包含哪些信息目前尚未明確，本研究結(jié)果顯示SAEs明顯抑制了腫瘤細(xì)胞內(nèi)BRD4/C-MYC通路。BRD4全稱為溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(bromodomain-containing protein 4)，為BET家族成員。有研究顯示，BRD4表達(dá)失調(diào)與血癌、乳腺癌及結(jié)腸癌等多種癌癥有關(guān)[10]。BRD4蛋白能夠與RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)正向轉(zhuǎn)錄延長因子(positive transcription elongation factor b，P-TEFb)結(jié)合共同參與MYC、BCL2和BCL6等癌基因的轉(zhuǎn)錄[11]。有研究表明，BRD4蛋白占據(jù)了超級增強(qiáng)子的基因位置，能讓癌細(xì)胞保持相對不成熟的類干細(xì)胞狀態(tài)，在一定程度上驅(qū)動癌癥[12]。本文SAEs抑制了BRD4水平，發(fā)揮其抑癌效果，相對于腫瘤來源EVs其抑制C-MYC效果更明顯。而腫瘤來源EVs，更多地顯示了促癌作用，不僅上調(diào)了C-MYC表達(dá)，對Rb與磷酸化Rb也有明顯抑制作用。

觀察SAEs對免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)作用發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞來源EVs和SAEs均可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，分化出的巨噬細(xì)胞會因誘導(dǎo)因素的不同而表現(xiàn)出不同表型和功能，即巨噬細(xì)胞的極化，表現(xiàn)為M1型和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞通過分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子,并專職提呈抗原,參與正向免疫應(yīng)答,發(fā)揮免疫監(jiān)視功能；M2型巨噬細(xì)胞僅有較弱抗原提呈能力,其通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和/或TGF-β等下調(diào)免疫應(yīng)答,在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[13]。本文利用腫瘤細(xì)胞來源EVs或SAEs作用THP-1細(xì)胞，引起胞內(nèi)相關(guān)分子變化。在腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞處于抑制狀態(tài)，這種抑制可能由腫瘤細(xì)胞分泌的EVs介導(dǎo)[14]。本研究結(jié)果顯示SAEs能夠顯著降低免疫細(xì)胞表達(dá)IL-10與TGF-β，減輕免疫抑制狀態(tài)。提示化療誘導(dǎo)衰老細(xì)胞分泌的胞外囊泡傳遞的信息有利于腫瘤預(yù)后。

綜上，AURKA抑制劑MLN8237可以誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞IMR32衰老，SAEs一方面通過抑制BRD4/C-MYC通路影響腫瘤細(xì)胞生長，另一方面通過影響巨噬細(xì)胞極化減輕免疫抑制，為臨床使用低劑量化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老從而限制腫瘤增殖提供理論依據(jù)。由于本文實驗觀察的時間點較早，且所檢測的信號通路蛋白不夠全面，SAEs對腫瘤預(yù)后不利的一面及其對微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞影響還有待進(jìn)一步研究。SAEs對腫瘤微環(huán)境影響的深入研究可為臨床化療效果評估提供參考。