程 潔 張 棟 謝麗麗 魏 強(qiáng) 康 林

顳頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征是口腔科臨床的常見病、多發(fā)病，其致病機(jī)理尚未完全清楚。顳頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征的病因復(fù)雜多樣，其中單側(cè)后牙缺失、牙體牙髓病等導(dǎo)致的偏側(cè)咀嚼是臨床常見引起顳頜關(guān)節(jié)紊亂病的原因之一。咬合異常導(dǎo)致的雙側(cè)髁突受力不均，外界壓力變化使得髁突軟骨細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)，凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有多樣性，使凋亡過程得到精確的調(diào)控。近年來對(duì)外界壓力刺激導(dǎo)致的髁突軟骨細(xì)胞的凋亡機(jī)制的研究多關(guān)注于細(xì)胞的基本轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[1～3]，而對(duì)非專一性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究較少。本研究通過造模單側(cè)后牙缺失大鼠，檢測(cè)凋亡蛋白caspase-12和蛋白激酶C-δ的變化，觀察蛋白質(zhì)激酶C-δ（protein kinase C-δ，PKC-δ）在髁突軟骨細(xì)胞凋亡非專一性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用及其與基本轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系。

資料和方法

1.動(dòng)物分組與取材：3周齡雄性SD大鼠（河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供）96只，體重160～190g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)等量分為8組，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各4組，每組12只。實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)10%水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉后，拔除左側(cè)上、下頜所有磨牙，拔牙后第 1d、7d、14d、28d，每組隨機(jī)選取 6 只，完整取出雙側(cè)髁突關(guān)節(jié)軟骨，于多聚甲醛中固定。另外6只，麻醉后直接取髁突軟骨凍存于-80℃冰箱中保存。對(duì)照組大鼠不做任何處理，與對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組同期處死并取材。

2.蘇木精-伊紅染色（HE染色）：組織塊固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片。常規(guī)脫水，透明，封片。

3.實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)：髁突軟骨于-80℃保存，用Trizol一步提取法提取總RNA。取5μl RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性。用TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。設(shè)計(jì)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，β-actin用作內(nèi)定參考。PCR反應(yīng)程序：95℃15min，95℃10s，58℃30s，72℃30s，循環(huán) 40 次。分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

用熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。根據(jù)RealTimePCR原始檢測(cè)結(jié)果，按照 2-△△ct相對(duì)定量計(jì)算公式，即：△△Ct=[Ct目的基因（實(shí)驗(yàn)組）- CtBeta基因（實(shí)驗(yàn)組）]-[Ct目的基因（對(duì)照組）-CtBeta基因（對(duì)照組）]。計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對(duì)于對(duì)照樣品目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

4.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組左、右側(cè)及對(duì)照組caspase-12和PKC-δ在髁突軟骨中的表達(dá)情況，以及各組內(nèi)同側(cè)髁突軟骨不同時(shí)間點(diǎn)的變化。

圖1 HE染色（ ×200）

圖2 HE染色（ ×200）

圖3 HE染色（ ×200）

圖4 HE染色（ ×200）

結(jié) 果

1.HE染色：大鼠髁突軟骨由表及里依次是纖維層，增殖層，肥大層及鈣化軟骨層。對(duì)照組中各層細(xì)胞界限清晰，排列整齊，未見退行性改變（圖1）。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)7天時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞排列紊亂，增殖層與肥大層界限開始模糊（圖2）。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)14天時(shí)肥大層與軟骨層細(xì)胞排列稀疏，可見胞核固縮（圖3）。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)28天時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞退行性變化，表層纖維斷裂松解，軟骨細(xì)胞可見核內(nèi)空泡性變（圖4）。

表1 拔牙后PKC-δ含量變化

表2 拔牙后caspase-12含量變化

2.RT-PCR結(jié)果：對(duì)照組PKC-δ和caspase-12的含量在不同時(shí)間點(diǎn)的左右側(cè)對(duì)比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），因此將對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)的左、右側(cè)合并為一組。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的PKC-δ和caspase-12含量均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)PKC-δ的含量在1d、7d、14d、28d時(shí)均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組右側(cè)PKC-δ含量各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組，1d、7d組有顯著性差異（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組左側(cè)PKC-δ各時(shí)間點(diǎn)均高于右側(cè)，7d、14d、28d組有顯著性差異（P＜0.05）。隨時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)PKC-δ含量逐漸升高，且各時(shí)間點(diǎn)較前一時(shí)間點(diǎn)增加有顯著性差異（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組右側(cè)PKC-δ逐漸降低，7d、14d組較前一時(shí)間點(diǎn)降低有顯著性差異（P＜0.05），14d、28d組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)caspase-12含量各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組右側(cè)caspase-12含量各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組，1d，7d，14d組有顯著性差異（P＜0.05）。隨時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)caspase-12含量逐漸升高，14d，28d時(shí)升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組右側(cè)caspase-12含量逐漸降低，在7d，28d時(shí)降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），28d時(shí)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。

討 論

髁突軟骨細(xì)胞的凋亡途徑中的凋亡蛋白酶caspases家族是重要的調(diào)控因子。caspase-12是細(xì)胞基本凋亡通路中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路的重要調(diào)控因子[2，4]。蛋白激酶 C（PKC）由一條單肽鏈組成，靜止細(xì)胞中PKC主要存在于胞漿中，細(xì)胞受到刺激后，PKC通過Ca2+依賴的形式從胞漿轉(zhuǎn)移到胞膜上，這一過程稱為PKC的轉(zhuǎn)位激活[5]。PKC是非專一性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中磷脂酶C-蛋白質(zhì)激酶C途徑的標(biāo)志蛋白。非專一性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和基本轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)質(zhì)是上下游的關(guān)系，因?yàn)榍罢咄枰ㄟ^激活后者才能誘導(dǎo)凋亡。PKC各亞型的作用也不同，如PKC-α、PKC-ε等與抗細(xì)胞凋亡關(guān)聯(lián)更為密切，而PKC-δ、PKC-μ、PKC-θ 與促凋亡相關(guān)[6]。PKC-δ屬于新型PKC亞家族，一般在胞漿中處于無(wú)活性狀態(tài)，當(dāng)受到外界凋亡信號(hào)刺激后，PKC-δ被二酰甘油（DAG）/佛波醇酯類激活，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。PKC-δ的活化處于凋亡途徑的早期，經(jīng)過進(jìn)一步的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活caspase-12，最終激活caspase-3，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。

本研究中實(shí)驗(yàn)組大鼠拔除左側(cè)后牙后，左側(cè)顳頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞中的caspase-12和PKC-δ含量均較對(duì)照組增加，且隨時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，說明左側(cè)髁突軟骨細(xì)胞受到拔牙后的炎癥刺激及正常咀嚼壓力的缺失產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞傳導(dǎo)胞外信號(hào)時(shí)，G蛋白偶聯(lián)受體接受細(xì)胞外第一信使，受體被活化，進(jìn)而激活G蛋白，G蛋白可進(jìn)一步激活磷脂酶C，進(jìn)而產(chǎn)生DAG，DAG與PKC-δ結(jié)合，使PKC-δ發(fā)生構(gòu)象變化，產(chǎn)生轉(zhuǎn)位激活，激活的PKC-δ轉(zhuǎn)移至胞膜等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，磷酸化相應(yīng)的底物，進(jìn)一步激發(fā)細(xì)胞凋亡途徑的下游事件基本轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，caspase-12含量的升高說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路激活，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)是三種基本轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，caspase-12進(jìn)一步激活caspase-9，最終激活caspase-3執(zhí)行細(xì)胞凋亡。因此PKC-δ和caspase-12的含量升高相輔相成。實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)caspase-12和PKC-δ含量高于對(duì)照組，但隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，可能由于拔牙初期，大鼠的咀嚼壓力全部轉(zhuǎn)移至右側(cè)，使得右側(cè)髁突軟骨受到突然增大的外界壓力發(fā)生細(xì)胞凋亡反應(yīng)。細(xì)胞凋亡不是病理狀態(tài)下的自體損傷，而是細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激主動(dòng)產(chǎn)生的自我調(diào)控反應(yīng)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，右側(cè)顳頜關(guān)節(jié)逐漸適應(yīng)新的咬合狀態(tài)，右側(cè)髁突軟骨細(xì)胞中的caspase-12和PKC-δ含量開始下降，至28天組時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。PKC-δ在細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制在腫瘤研究中較為深入[7]，但其對(duì)不同類型的應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制尚未完全清晰，仍需進(jìn)一步研究。PKC-δ的激活與caspase家族的水解切割密切相關(guān)，凋亡初期，由PKC-δ的構(gòu)象變化引起轉(zhuǎn)位激活，但其激活后與各凋亡蛋白間的詳細(xì)傳導(dǎo)通路尚不完全清楚。PKC-δ促凋亡的特性在許多腫瘤藥物的研究中發(fā)揮了重要作用[8～10]，但在髁突軟骨細(xì)胞代謝途徑的研究較少，進(jìn)一步明確PKC-δ的相互作用蛋白，明確其促凋亡的作用機(jī)制，對(duì)于解釋單側(cè)咀嚼導(dǎo)致的顳頜關(guān)節(jié)紊亂病的疾病發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程具有意義。