張 淳 許麗華

成牙本質細胞位于牙髓最外圍，是最早接觸外界刺激的細胞，可以更早更敏感的反映牙髓組織的損傷修復反應。本實驗通過研究不同齲深標本中成牙本質細胞的凋亡情況及Bcl-2、Bax的表達情況，探討B(tài)cl-2、Bax在齲病進展中的變化規(guī)律。

資料和方法

一、實驗主要儀器和試劑

石蠟包埋機、RM2255半自動切片機、303AS-1型數(shù)顯隔水式培養(yǎng)箱、CX41多功能顯微鏡、CX40多功能顯微鏡、Bcl-2及Bax鼠抗人單克隆抗體、超敏型二步法檢測試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒。

二、實驗標本

經患者知情同意，選牙根發(fā)育完成且可完整拔除，但無治療與保留價值的第三磨牙，病損均為牙合面慢性齲，正常牙、淺齲、中齲和深齲各20顆。拔出后即刻截根固定，脫鈣，石蠟包埋、切片。

三、實驗方法

1.HE染色：HE染色，光鏡下（400倍）測量100μm成牙本質細胞層長度的成牙本質細胞數(shù)目，測定區(qū)域選擇在髓頂中部下方，如果有修復性牙本質形成，測量其下方的成牙本質細胞數(shù)目。

2.TUNEL染色：切片脫蠟至水，胰蛋白酶消化液37℃孵育30min，TUNEL反應混合液37℃孵育1h，converter-POD 37℃ 孵 育 30min，DAB 顯 色5min，蘇木素復染，脫水透明，封片。陰性對照省略TdT。

胞核2/3為棕黃色或褐色的細胞為凋亡細胞。觀察部位及計數(shù)方法同HE染色。計算凋亡指數(shù)：AI=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

3.免疫組化染色：切片脫蠟至水，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性，Bcl-2或Bax鼠抗人單克隆抗體工作液37℃孵育2h，polymer Helper 37℃孵育 30min，poly-HRP anti-MouseIgG 37℃ 孵 育30min，DAB顯色5min，蘇木素復染，脫水透明，封片。Bcl-2和Bax均以胞漿內出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色。觀察部位同HE染色。采用Motic medical 6.0圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。

四、統(tǒng)計學分析

使用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、HE染色

正常牙組（A）和淺齲組（B）：未見修復性牙本質形成，成牙本質細胞體積大、數(shù)量多，排列整齊連續(xù)，呈高柱狀，胞漿豐富，數(shù)量約為15.42（正常牙組）和15.71（淺齲組）。

中齲組（C）：大部分中齲齲損部位下方有修復性牙本質形成，厚度不一，其下方的成牙本質細胞數(shù)量銳減，約為9.91，呈矮柱狀或立方狀，胞漿較少。

圖1 HE染色，×400

圖2 TUNEL染色，×400

圖3 Bcl-2免疫組化染色，×400

圖4 Bax免疫組化染色，×400

深齲組（D）：齲損部位下方均有較厚修復性牙本質形成，其下方的成牙本質細胞減少至6.41，單層排列，細胞呈立方狀或扁平狀，體積小，胞漿少。

實驗結果及統(tǒng)計分析詳見附表1。

二、TUNEL染色

實驗結果及統(tǒng)計分析見附表2。

三、免疫組織化學染色

表1 成牙本質細胞細胞數(shù)目及蛋白表達情況

表2 凋亡細胞指數(shù)

蛋白Bcl-2和Bax在牙髓組織中均呈陽性表達，成牙本質細胞層染色較固有牙髓細胞明顯。實驗結果及統(tǒng)計分析詳見附表1。

討 論

因牙冠有釉質包裹，正常情況下外界的刺激不會引起牙髓反應，所以正常牙無修復性牙本質形成。偶然存在的細胞凋亡是維持牙髓細胞數(shù)目穩(wěn)定的重要方式，這與Mitsiadis[1]等學者的研究結果是一致的。成牙本質細胞數(shù)量多，體積大，胞漿豐富，說明細胞狀態(tài)良好，具有較強的防御修復能力。

淺齲組牙髓與正常牙組無明顯區(qū)別。推測牙本質尚未暴露，淺齲對成牙本質細胞的影響并不明顯。這與方碧松[2]的研究結果是一致的。偶見凋亡細胞，但分布散在，無集中趨勢，考慮為細胞的正常生理凋亡。成牙本質細胞狀態(tài)良好，具有較強的防御修復能力。

中齲組TUNEL染色顯示齲損下方成牙本質細胞的凋亡指數(shù)升高，與Mitsiadis等學者[3]的研究結果一致。凋亡增多提示此時細菌及內毒素可以經暴露的牙本質小管刺激成牙本質細胞突起，進而引起胞體的凋亡。中齲組成牙本質細胞的數(shù)量因凋亡增多而減少，同時體積變小，胞漿變少，使得成牙本質細胞的修復能力下降。所以一旦齲病進展到中齲后，就要對近髓處進行護髓處理，以減少粘接劑及充填材料對牙髓組織的刺激。

深齲組中，修復性牙本質下方的成牙本質細胞呈立方狀甚至扁平狀，可能是因為大量的刺激物影響了牙髓細胞向成牙本質細胞的分化成熟，使細胞停留于分化的某一階段；也有可能是因為細胞的數(shù)目過少，相互之間缺乏擠壓，所以彼此平鋪成扁平狀。隨著齲損的加深，剩余牙本質不斷變薄，對外通透性明顯增加，使得牙髓組織對外界刺激更加敏感，損傷反應亦更為嚴重[4]，深齲組的修復性牙本質較中齲組厚且范圍廣泛。由于細胞大量凋亡，修復性牙本質下方的成牙本質細胞數(shù)量很少，而且體積小、胞漿少，修復防御能力很差。此時即使去除外界刺激進行護髓充填治療，受損的牙髓也較難恢復正常[5]。

Bcl-2是最早發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因，可顯著延長細胞的壽命，抑制其發(fā)生凋亡[6，7]；Bax的微觀結構形態(tài)與Bcl-2極為相似，是Bcl-2活性的主要調控因子。Bax可以與Bcl-2結合成異源二聚體發(fā)揮抗凋亡作用，還可以形成同源二聚體誘導細胞凋亡[8]。

本實驗結果顯示，正常牙組和淺齲組中Bcl-2、Bax的表達水平均較低。提示兩蛋白的表達量處于平衡狀態(tài)或Bcl-2占少許優(yōu)勢，細胞凋亡的易感性差，故少有成牙本質細胞凋亡。

中齲組中Bcl-2、Bax的表達水平均升高，Bax增高幅度較為明顯（Bcl-2/Bax為0.841）；深齲組中，兩蛋白的表達水平更高，Bax的增高幅度尤為明顯（Bcl-2/Bax為0.776）。其機理可能是：在齲損刺激強度較大時，細胞內Bax基因被大量激活，其調控表達的Bax也就明顯增多，使得Bcl-2/Bax比值降低；此時，為了平衡Bcl-2和Bax的比例，Bcl-2也被激活，其調控的Bcl-2也相應增加。但即使如此，Bcl-2/Bax比值仍舊呈降低趨勢，使得細胞凋亡的易感性增加，出現(xiàn)明顯的細胞凋亡，造成成牙本質細胞數(shù)目銳減。這與成牙本質細胞計數(shù)結果和凋亡指數(shù)是一致的。

本研究發(fā)現(xiàn)，Bax在齲病進展中變化幅度最明顯，Bcl-2/Bax比值是成牙本質細胞應對外界刺激的重要調控因素。