李文詠，王夢(mèng)瑩，周 仁，王斯悅，鄭鴻塵，朱洪平，周治波，吳 濤，3△，王 紅，石 冰

(1. 北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，北京 100191； 2. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，口腔頜面外科 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；3. 衛(wèi)生部生育健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191； 4. 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

非綜合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P)是由于胚胎發(fā)育過(guò)程中頜腭組織發(fā)育不全或發(fā)育受阻而引起的一組頜面部先天性畸形，中國(guó)唇腭裂患病率約為每1 000活產(chǎn)兒1.4人[1]。唇腭裂按解剖學(xué)結(jié)構(gòu)可分為單純唇裂(cleft lip, CL)、單純腭裂(cleft palate, CP)、唇裂合并腭裂(cleft lip and palate, CLP)。由于單純唇裂和唇裂合并腭裂具有相似的胚胎起源和流行病學(xué)特征，因此CL和CLP通常被合并為唇裂合并或不合并腭裂(cleft lip with or without cleft palate, CL/P)一類[2-3]。CL/P和CP通常被認(rèn)為是兩種不同類型的缺陷，因?yàn)樗鼈兊呐咛テ鹪床煌琜4]；患病率不同，CL/P患病率高于CP，并且CP患者中女性約為男性的兩倍，而CL/P患者男性則是女性的兩倍[5]。NSCL/P是多個(gè)遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病，全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)是研究復(fù)雜疾病致病基因的高效定位方法。2009年Grant等[6]通過(guò)GWAS研究發(fā)現(xiàn)8q24與NSCL/P相關(guān)，由此開(kāi)始了探索非綜合征型唇腭裂遺傳危險(xiǎn)因素的GWAS研究時(shí)代。GWAS研究不僅驗(yàn)證了既往發(fā)現(xiàn)的候選基因，還發(fā)現(xiàn)了新的易感基因或區(qū)域[7]，有研究者發(fā)現(xiàn)大部分常見(jiàn)變異組合起來(lái)僅能增加較小程度的疾病風(fēng)險(xiǎn)，解釋了少部分的遺傳度[8]，并且這些GWAS研究主要探索患兒易感基因?qū)τ诩膊★L(fēng)險(xiǎn)的影響。因此，探索罕見(jiàn)遺傳變異的致病效應(yīng)、遺傳因素的交互作用、遺傳-環(huán)境交互作用、親源效應(yīng)、表觀遺傳等是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。親源效應(yīng)(parent-of-origin effects，PoO)是指親本來(lái)源染色體上的等位基因出現(xiàn)差異表達(dá)，即兩個(gè)親本等位基因中一方表達(dá)，另一方沉默，表現(xiàn)為依靠單親傳遞某些遺傳學(xué)性狀的現(xiàn)象[9]。大部分已知的具有親源效應(yīng)的基因與胚胎發(fā)育密切相關(guān)，而非綜合征型唇腭裂是由于胚胎發(fā)育過(guò)程中頜腭組織發(fā)育不全或發(fā)育受阻引起的出生缺陷。因此探索PoO與NSCL/P發(fā)病的關(guān)聯(lián)，或可進(jìn)一步揭開(kāi)NSCL/P的病因。

Hedgehog(HH)通路在胚胎時(shí)期的細(xì)胞分化、組織發(fā)育及器官形成中發(fā)揮重要的作用，尤其與頜面部形態(tài)形成密切相關(guān)。HH通路基因主要包括分泌型糖蛋白配體基因SHH、跨膜蛋白受體基因PTCH1、PTCH2，跨膜蛋白基因SMO及其下游靶基因。當(dāng)SHH存在時(shí)，解除PTCH對(duì)SMO的抑制，從而SMO發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和激活下游靶基因的作用。HH通路基因關(guān)系見(jiàn)圖1(來(lái)源于KEGG PATHWAY Database，http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。Yu等[10]在中國(guó)人群進(jìn)行的GWAS研究發(fā)現(xiàn)，PTCH1基因的rs10512248位點(diǎn)與NSCLP密切相關(guān)。目前的研究主要涉及HH通路單個(gè)基因多態(tài)性與NSCL/P的關(guān)聯(lián)，因此本研究旨在806個(gè)中國(guó)NSCL/P核心家庭中探索HH通路基因是否通過(guò)親源效應(yīng)影響NSCL/P的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象為806個(gè)中國(guó)NSCL/P核心家系，通過(guò)“唇腭裂基因和交互作用的國(guó)際合作研究”項(xiàng)目于2003年至2007年在中國(guó)臺(tái)灣、山東、湖北、四川4個(gè)地區(qū)募集，合計(jì)2 418人。806個(gè)家系的地區(qū)來(lái)源、性別分布見(jiàn)表1。該項(xiàng)目的研究設(shè)計(jì)、樣本收集、環(huán)境暴露信息參見(jiàn)Beaty等[11]的研究，該研究開(kāi)始前均已獲得合作組各單位的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒唇腭裂病理類型由臨床遺傳學(xué)家或經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師確定，確保納入患兒均為NSCL/P類型，納入家系的父母均簽署知情同意書(shū)，通過(guò)靜脈血、唾液或漱口水等生物標(biāo)本提取DNA。

表1 806個(gè)中國(guó)NSCL/P核心家系分布情況Table 1 The distribution of 806 NSCL/P case-parent trios in China

1.2 基因型測(cè)定和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)遺傳病研究中心利用Illumina公司 Human610-Quad v.1_B芯片完成基因型測(cè)定，納入的位點(diǎn)經(jīng)過(guò)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，排除位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)為：(1)基因型缺失率>5%；(2)弱勢(shì)等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)<5%；(3)父母偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.000 1)；(4)孟德?tīng)栠z傳錯(cuò)誤率>5%。原始研究納入4個(gè)基因共83個(gè)位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，因MAF刪除掉18個(gè)位點(diǎn)，故研究納入65個(gè)位點(diǎn)。該篩選過(guò)程通過(guò)Plink(版本號(hào)1.07, http://pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/plink/data.shtml)軟件完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.3.1關(guān)聯(lián)分析 采用傳遞不平衡檢驗(yàn)(transmission disequilibrium test，TDT)探索基因位點(diǎn)與疾病的關(guān)聯(lián)關(guān)系。其無(wú)效假設(shè)為雜合子父母?jìng)鬟f任一等位基因給子代的概率為50%，拒絕無(wú)效假設(shè)提示該遺傳標(biāo)記位點(diǎn)與潛在致病位點(diǎn)存在連鎖并處于連鎖不平衡狀態(tài)。TDT也可用于檢測(cè)單體型與疾病間的關(guān)聯(lián)。單體型(haplotype)是位于一條染色體特定區(qū)域的一組相互關(guān)聯(lián)、傾向于整體遺傳給后代的單核苷酸多態(tài)性的組合。單體型通過(guò)滑窗法構(gòu)建，分別以2個(gè)、3個(gè)SNPs作為一個(gè)單體型進(jìn)行TDT檢驗(yàn)。采用Plink v1.07進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

1.3.2親源效應(yīng)分析 采用構(gòu)建對(duì)數(shù)線性模型的方法分析PoO效應(yīng)[12]，計(jì)算PoO效應(yīng)時(shí)，通過(guò)最大似然估計(jì)方法，比較患兒易感位點(diǎn)來(lái)自母親的相對(duì)危險(xiǎn)度RRm與來(lái)自父親的相對(duì)危險(xiǎn)度RRf：

RRR=RRm/RRf

公式1

若RRR=1，說(shuō)明不存在PoO效應(yīng)[13-14]。Haplin應(yīng)用EM(expectation maximization)算法，通過(guò)最大似然估計(jì)確定目標(biāo)等位基因的父母來(lái)源。探索PoO效應(yīng)采用兩種策略：(1)單個(gè)位點(diǎn)分析；(2)單體型分析：通過(guò)滑窗法構(gòu)建，分別以2個(gè)、3個(gè)SNPs作為一個(gè)單體型檢驗(yàn)PoO效應(yīng)。研究的顯著性水平為7.7×10-4。相關(guān)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件R 3.4.2中的Haplin v6.2.1程序包[12]。本研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析部分采用Bonferroni法校正多重檢驗(yàn)問(wèn)題，顯著性水平設(shè)為0.05/65=7.7×10-4。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)聯(lián)分析

納入65個(gè)SNPs進(jìn)行TDT檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs4448343與NSCL/P的關(guān)聯(lián)有意義(P<0.05)， 經(jīng)過(guò)多重檢驗(yàn)校正，該關(guān)聯(lián)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>7.7×10-4)。

進(jìn)行單體型與NSCL/P的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，以2個(gè)SNPs為一個(gè)單體型，共得到196種單體型，其中3個(gè)單體型TDT檢驗(yàn)P<0.05；以3個(gè)SNPs為一個(gè)單體型，得到單體型269種，其中3個(gè)單體型TDT檢驗(yàn)P<0.05。進(jìn)行Bonferroni校正后，所有單體型與NSCL/P的關(guān)聯(lián)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2列出了P<0.05的SNP位點(diǎn)和單體型。

2.2 PoO效應(yīng)

單個(gè)SNP位點(diǎn)的PoO效應(yīng)分析中未發(fā)現(xiàn)任何SNP具有潛在的親源效應(yīng)。表3顯示了單體型PoO分析結(jié)果中RRR的P值小于0.05的單體型。單體型分析中，6個(gè)單體型PoO檢驗(yàn)P<0.05：以2個(gè)SNPs為一個(gè)單體型，2個(gè)單體型P<0.05(rs288765-rs1233563和rs12537550-rs11765352)；以3個(gè)SNPs為一個(gè)單體型，4個(gè)單體型P<0.05(rs872723-rs288765-rs1233563、rs288765-rs1233563-rs288756、rs6459952-rs12537550-rs11765352、rs12537550-rs11765352-rs6971211)。經(jīng)過(guò)多重檢驗(yàn)校正，所有結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 806個(gè)中國(guó)NSCL/P核心家系傳遞不平衡檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 The selected single SNP and haplotype association results with nominal significance based on TDT in 806 Chinese case-parents trios

表3 806個(gè)中國(guó)NSCL/P核心家系PoO效應(yīng)結(jié)果Table 3 The results of PoO effects in 806 Chinese case-parents trios

3 討論

本研究選擇HH通路的4個(gè)基因(PTCH1、PTCH2、SHH、SMO)在806個(gè)中國(guó)人群NSCL/P核心家系中，針對(duì)單個(gè)SNP和單體型分別進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析以及PoO效應(yīng)探索。HH信號(hào)通路與胚胎發(fā)育密切相關(guān)，尤其在頜面部形態(tài)形成中發(fā)揮重要作用[15]，其中Ptch1蛋白在HH通路中具有重要功能，當(dāng)Hh蛋白未與Ptch1結(jié)合時(shí)，HH通路受到抑制；當(dāng)兩者結(jié)合后，解除對(duì)Smo的抑制，HH通路激活，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄活動(dòng)[16]。唇腭裂發(fā)病受遺傳因素影響，其發(fā)病呈現(xiàn)家族聚集性。傳統(tǒng)雙生子研究和家系研究均表明遺傳因素在其發(fā)病中有重要的作用[17]。雙生子研究發(fā)現(xiàn)同卵雙胞胎的患病一致率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于異卵雙胞胎，CL/P分別為50%和8%，CP則分別為33%和7%[18]。近年來(lái)開(kāi)展的GWAS發(fā)現(xiàn)了多個(gè)致病基因或候選基因[ 6, 10-11,19-20]。本研究納入的4個(gè)基因中，既往研究發(fā)現(xiàn)PTCH1基因突變導(dǎo)致基底細(xì)胞癌綜合征(basal cell nevus syndrome, BCNS，OMIM 109400)， 該病屬于孟德?tīng)栠z傳病，病人可伴有唇腭裂、眼畸形等出生缺陷[21]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)PTCH1基因缺失會(huì)導(dǎo)致鼠顱面部缺陷，包括腭發(fā)育不全、繼發(fā)腭裂[22]。Yu等[10]在中國(guó)人群進(jìn)行的GWAS(genome-wide association studies)研究發(fā)現(xiàn)，PTCH1基因的rs10512248位點(diǎn)與NSCLP密切相關(guān)。Xiao等[23]利用NSCL/P的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序數(shù)據(jù)探索可能存在的基因-基因交互作用，研究發(fā)現(xiàn)rs3761910(ARHGAP29)與rs2149722(PTCH1)交互作用在亞洲人群中達(dá)到顯著水平。研究者在巴西人群中發(fā)現(xiàn)SHH基因是NSCLP的遺傳危險(xiǎn)因素[24]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)SMO與多種癌癥相關(guān)。目前研究尚未發(fā)現(xiàn)SMO與唇腭裂的發(fā)生相關(guān)。當(dāng)人群中NSCL/P的患病率為0.12%時(shí)，本研究納入806個(gè)核心家系有80%的把握度，可以發(fā)現(xiàn)單個(gè)位點(diǎn)與NSCL/P的真實(shí)關(guān)聯(lián)(雙側(cè)檢驗(yàn)α=0.05，MAF=0.2，RR>1.3)。本研究未能發(fā)現(xiàn)HH通路相關(guān)基因與NSCL/P的關(guān)聯(lián)，未來(lái)可通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步的探索。

PoO效應(yīng)被認(rèn)為是遺傳因素可能的其他生物學(xué)機(jī)制之一，已有一些研究探索PoO效應(yīng)在NSCL/P發(fā)病中的作用。2005年，研究者發(fā)現(xiàn)子代胱硫醚β-合酶基因(CBS)的c.844ins68位點(diǎn)來(lái)自母親時(shí)，與該位點(diǎn)遺傳自父親相比，子代NSCL/P的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加18.7倍[25]。2008年Reutter等[26]利用204個(gè)中歐NSCL/P核心家系探索TGFB3在NSCL/P發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中的作用。研究發(fā)現(xiàn)子代的rs2300607來(lái)自母親與來(lái)自父親相比，其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低(IM=0.38， 95%CI0.17～0.86)(IM=1表示不存在親源效應(yīng))。Sull等[27-29]納入297個(gè)核心家系的樣本，分別探索Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2基因(runt-related transcription factor 2 gene，RUNX2)、轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子α基因(transforming growth factor alpha，TGFA)、配對(duì)框轉(zhuǎn)錄因子基因(paired box transcript factor genes，PAX3,PAX6，PAX7，PAX9)的PoO效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)RUNX2的3個(gè)SNPs、TGFA的兩個(gè)SNPs、PAX7的兩個(gè)SNPs與PAX3的4個(gè)SNPs結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2010年，Suazo等[30]通過(guò)150個(gè)智利NSCL/P核心家系探索MSX1可能的PoO效應(yīng)在唇腭裂發(fā)病中的作用,發(fā)現(xiàn)rs12532位點(diǎn)的A等位基因來(lái)自父親時(shí)子代患病風(fēng)險(xiǎn)增加2.08倍(95%CI: 1.10～4.02)，MSX1通過(guò)基因印跡影響NSCL/P的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Shi等[31]納入2 000多個(gè)非綜合型唇腭裂核心家系探索親源效應(yīng)，研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)達(dá)到GWAS顯著水平的SNP位點(diǎn)。Garg等[32]在2 500個(gè)核心家系探索PoO效應(yīng)，研究提示PoO效應(yīng)與唇腭裂病因相關(guān)。目前，探索HH通路基因相關(guān)親源效應(yīng)對(duì)NSCL/P發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)影響的研究較罕見(jiàn)。本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)HH通路基因與NSCL/P的關(guān)聯(lián)，可能的原因是位點(diǎn)數(shù)目多，使得檢驗(yàn)次數(shù)增加，SNP位點(diǎn)間具有相關(guān)性，而B(niǎo)onferroni校正法較為保守。本研究發(fā)現(xiàn)SHH基因可通過(guò)單體型表現(xiàn)出PoO效應(yīng)，但經(jīng)多重檢驗(yàn)校正后沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究采用核心家系設(shè)計(jì)，核心家系包括患兒及其父母，亦可稱為病例-雙親(case-parent trios)設(shè)計(jì)，采用該設(shè)計(jì)類型可探索親源效應(yīng)，這一優(yōu)勢(shì)是普通病例對(duì)照研究所不具備的。由于需要招募患兒父母為研究對(duì)象，更適用于探索復(fù)雜疾病特別是生命早期的疾病比如NSCL/P的病因,這種設(shè)計(jì)還可以控制人群分層造成的混雜。本研究采用單位點(diǎn)以及單體型進(jìn)行TDT檢驗(yàn)和探索PoO效應(yīng)，相對(duì)于單位點(diǎn)分析，單體型會(huì)產(chǎn)生更多雜合的個(gè)體，從而提供更多的信息并增加把握度[33]。本研究雖未發(fā)現(xiàn)具有PoO效應(yīng)的基因，但未來(lái)可在特定環(huán)境因素暴露條件下或者在更大樣本量的人群中進(jìn)行進(jìn)一步探索。本研究采用了中國(guó)人群NSCL/P的GWAS數(shù)據(jù)，值得注意的是GWAS研究只關(guān)注MAF>0.01的常見(jiàn)遺傳變異位點(diǎn)，因此今后可在中國(guó)唇腭裂人群中進(jìn)行測(cè)序研究，探索罕見(jiàn)遺傳變異及其他遺傳變異不同作用方式對(duì)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響，為NSCL/P的發(fā)病機(jī)制研究提供更多的線索。

綜上所述，本研究利用來(lái)自“唇腭裂基因和交互作用的國(guó)際合作研究”項(xiàng)目在中國(guó)地區(qū)募集的806 個(gè)NSCL/P核心家系數(shù)據(jù)，從單位點(diǎn)以及單體型進(jìn)行TDT檢驗(yàn)和PoO效應(yīng)探索，深入探索HH通路相關(guān)基因在中國(guó)人群NSCL/P發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中的作用，經(jīng)過(guò)Bonferroni 多重檢驗(yàn)校正后，未能發(fā)現(xiàn)達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平的結(jié)果。本研究未能在研究人群中發(fā)現(xiàn)顯著的親源效應(yīng)，但不能據(jù)此認(rèn)為PoO效應(yīng)對(duì)NSCL/P發(fā)病沒(méi)有影響。與患兒基因主效應(yīng)相比，PoO效應(yīng)屬于更高階的效應(yīng)，因此需要更大的樣本量，本研究的樣本量可能不足以發(fā)現(xiàn)PoO效應(yīng)；相關(guān)基因也可能在特定環(huán)境因素下才表現(xiàn)出PoO效應(yīng)，或者PoO與環(huán)境因素交互作用影響子代發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。未來(lái)可采取擴(kuò)大樣本量、綜合分析PoO與環(huán)境因素的作用來(lái)進(jìn)一步探索PoO效應(yīng)在發(fā)病中的作用。