候 越，趙旭彤，謝志穎，袁 云，王朝霞

(北京大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100034)

線粒體疾病是因線粒體基因或核基因組中編碼線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白的基因突變所致的一組疾病。根據(jù)不同臨床表現(xiàn)的組合，分為不同的臨床綜合征[1]，其中線粒體腦肌病伴乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作(mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes，MELAS)、肌陣攣性癲癇伴破碎紅纖維(clonus epilepsy with ragged-red fibers，MERRF)、Leigh綜合征(Leigh syndrome，LS)、Leber遺傳性視神經(jīng)病(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)、慢性進(jìn)行性眼外肌癱瘓(chronic progressive external ophthalmoplegia，CPEO)和Kearns-Sayre綜合征(Kearns-Sayre syndrome，KSS)等較為常見。MELAS綜合征核心癥狀是以累及大腦皮層為主的卒中樣發(fā)作，以及癡呆、癲癇、乳酸酸中毒、肌病、頭痛、聽力下降、糖尿病和身材矮小等，80%的患者為編碼線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA，tRNA)Leu的m.3243A>G突變[2]。MERRF綜合征以肌陣攣、全面性癲癇、小腦性共濟(jì)失調(diào)為核心癥狀，超過80%的患者由編碼線粒體tRNALys的m.8344A>G突變所致[3]。Leigh綜合征，又稱亞急性壞死性腦病，常表現(xiàn)為精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩或倒退，癲癇發(fā)作，以及眼外肌癱瘓、眼球震顫、肌張力障礙或呼吸異常等腦干或基底節(jié)受累的癥狀，影像學(xué)以雙側(cè)對(duì)稱的腦干和(或)基底節(jié)T2序列局限性高信號(hào)為特點(diǎn)[4]，分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)20%的Leigh患者為線粒體DNA突變， 80%為核基因突變所致[3]。文獻(xiàn)報(bào)道部分患者可以表現(xiàn)為兩種線粒體綜合征的疊加，如MELAS/MERRF[5-6]、MELAS/Leigh[7-8]、MERRF/Leigh[9-10]、MELAS/KSS[11]、MERRF/KSS[12]等兩種疾病類型的重疊，但線粒體疾病三者疊加綜合征尚少見報(bào)道。本文報(bào)道1例罕見的m.8344A>G突變引起的MELAS/MERRF/Leigh共3種疾病的重疊綜合征。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

隨訪觀察1例2013年12月就診于北京大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科通過臨床病理檢查診斷的線粒體病MELAS/MERRF/Leigh重疊綜合征患者。收集患者臨床資料，影像學(xué)檢查隨訪顱內(nèi)病灶改變?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?/p>

1.2 基因突變分析

1.2.1PCR-RFLP及限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng) 提取患者及其母親的外周血白細(xì)胞DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)對(duì)mtDNA常見突變(3243A>G，8344A>G，8993T>C)進(jìn)行檢測。m.8344A>G的正向引物為5′-TACCCTATAGCACCCCCTCT-3′，反向引物為5′-TAGTATTTAGTTGGGGCATTTCACTGTAAAGCCG-TGTTGG-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，含DNA模板1.0 μL，引物各0.5 μL，Tag酶 12.5 μL和蒸餾水10.5 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)后于72 ℃延伸7 min，4 ℃冷卻。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物10 μL，加入限制性內(nèi)切酶BgⅡ 0.5 μL，10×酶切緩沖液2 μL，蒸餾水7.5 μL，在37 ℃水浴酶切2 h。最后以2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上檢測酶切產(chǎn)物的電泳條帶。

1.2.2高通量測序及數(shù)據(jù)分析 為排除mtDNA其他位點(diǎn)突變，對(duì)患者mtDNA進(jìn)行二代測序分析。應(yīng)用mtDNA探針捕獲技術(shù)，mtDNA經(jīng)富集后在Illumina HiSeq X-ten平臺(tái)上進(jìn)行高通量測序。使用BWA(版本0.7.15, http://bio-bwa.sourceforge.net)將線粒體基因組測序序列與MITOMAP數(shù)據(jù)庫(https://www.mitomap.org/MITOMAP)中的參考序列(NC_012920.1.)進(jìn)行比對(duì), 平均測序深度為10 000×，超過95.0%的目標(biāo)區(qū)域測序深度大于1 000×。使用VarScan(2.4.0)檢測線粒體基因組單核苷酸變異及小片段缺失插入變異，LUMPY(0.2.13)檢測大片段結(jié)構(gòu)變異。

1.2.3Sanger測序 對(duì)發(fā)現(xiàn)的可疑致病性變異進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證(患者及其母親外周血DNA)。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

患者男性，25歲，出生后生長發(fā)育正常，但6歲后運(yùn)動(dòng)耐力差。10歲時(shí)突發(fā)視物不清,右側(cè)偏盲，頭顱磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI，圖1)示左側(cè)枕葉皮層長T1及長T2信號(hào)，DWI高信號(hào)(圖1A、1B)，頭顱磁共振血管成像(magnetic resonance angiography, MRA)未見異常。20 d后又出現(xiàn)左側(cè)偏盲，頭顱MRI示雙側(cè)枕葉皮層長T1及長T2信號(hào)，磁共振波譜成像(magnetic resonance spectroscopy，MRS)示病灶內(nèi)乳酸峰(lactate peak)升高及N-乙酰天門冬氨酸(N-acetyl aspartate，NAA)峰降低(圖1C、1D)。給予對(duì)癥治療后視野缺損逐漸好轉(zhuǎn)，復(fù)查頭顱MRI異常信號(hào)消失。外院行肱二頭肌肌肉活檢可見破碎紅纖維(ragged-red fiber，RRF)，診斷為MELAS綜合征。此后患者逐漸出現(xiàn)智能倒退。12歲時(shí)逐漸出現(xiàn)行走不穩(wěn)，寫字時(shí)手抖，四肢時(shí)有陣發(fā)性快速抽動(dòng)，予左乙拉西坦抗癲癇治療，抽動(dòng)癥狀逐漸控制。17歲時(shí)患者因行走不穩(wěn)摔倒致左上肢骨折并行骨折固定術(shù)。18歲于全身麻醉下行拆除骨折內(nèi)固定術(shù)，術(shù)后患者行走不穩(wěn)及肢體抖動(dòng)等癥狀加重。21歲時(shí)患者出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，記憶力減退，答非所問，陣發(fā)性煩躁，入北京大學(xué)第一醫(yī)院治療。父母非近親結(jié)婚，家族中無遺傳病史，母親無糖尿病、聽力減退及類似疾病史。

入院體格檢查：皮膚散在痤瘡，呼吸節(jié)律正常。精神淡漠，反應(yīng)遲鈍，問話不答，高級(jí)皮層功能檢查不配合。雙側(cè)瞳孔等大、等圓，對(duì)光反射靈敏，雙眼球各向活動(dòng)充分，無眼震。雙側(cè)額紋、眼裂及鼻唇溝對(duì)稱。四肢肌力Ⅳ級(jí)，肌張力偏低，雙手平舉及站立時(shí)可見四肢不自主震顫，四肢時(shí)有陣發(fā)性快速抽動(dòng)，雙側(cè)指鼻試驗(yàn)、跟膝脛試驗(yàn)欠穩(wěn)準(zhǔn)，輪替動(dòng)作笨拙。雙上肢腱反射對(duì)稱減弱，雙下肢腱反射消失，雙下肢病理征(+)。

2.2 診療經(jīng)過

自身免疫抗體、銅藍(lán)蛋白、尿代謝篩查未見異常。心電圖、超聲心動(dòng)未見異常。血乳酸 3.9 mmol/L，丙酮酸116 μmol/L，肌酸激酶164 IU/L。糖耐量試驗(yàn)正常，無低血糖發(fā)作。頭顱MRI示雙側(cè)殼核后部及雙側(cè)丘腦對(duì)稱性長T1長T2信號(hào)，DWI高信號(hào)(圖1E、1F)。腦電圖示δ波為主，雙額、右枕、前顳少量不典型三相波單個(gè)發(fā)放。給予輔酶Q10、左卡尼汀、精氨酸、三磷酸腺苷二鈉及多種維生素改善線粒體功能，左乙拉西坦抗癲癇，醋酸潑尼松短期使用?；颊呔駹顟B(tài)一度逐漸好轉(zhuǎn)，可以與人交流，言語清晰流利，反應(yīng)尚靈敏。但入院后半月余患者再次出現(xiàn)精神欠佳、反應(yīng)遲鈍、主動(dòng)語言減少，癲癇發(fā)作頻率增加。復(fù)查頭顱MRI示雙側(cè)額葉及雙側(cè)大腦腳新發(fā)長T1及長T2信號(hào)，DWI高信號(hào)(圖1G、1H)，雙側(cè)殼核后部及丘腦異常信號(hào)范圍較前擴(kuò)大。繼續(xù)給予改善線粒體能量代謝、清除自由基的藥物，加用氯硝西泮控制癲癇，醋酸潑尼松加量，以及營養(yǎng)支持、物理康復(fù)等對(duì)癥治療?；颊卟∏樵俅魏棉D(zhuǎn)，可進(jìn)行簡單交流，可在家人攙扶下站立。聽力檢查未見異常。

出院后隨訪，患者生活基本能自理。24歲復(fù)查頭顱MRI示雙側(cè)基底節(jié)及丘腦病灶范圍較前縮小，大腦皮層及大腦腳病灶消退(圖1I、1J)。

2.3 基因突變結(jié)果

PCR-RFLP示患者血液mtDNA存在m.8344A>G突變。二代測序?qū)颊哐簃tDNA全長進(jìn)行擴(kuò)增，同樣發(fā)現(xiàn)m.8344A>G突變，依據(jù)測序深度計(jì)算突變比例為90%，且未發(fā)現(xiàn)其它線粒體位點(diǎn)的突變。Sanger測序驗(yàn)證了m.8344位點(diǎn)A>G的突變。家系驗(yàn)證其母親血液mtDNA存在相同位點(diǎn)突變，突變比例約為10%(圖2)。

3 討論

本例患者自幼有運(yùn)動(dòng)不耐受，在10歲時(shí)出現(xiàn)急性發(fā)生的偏盲，頭顱MRI顯示枕葉皮層病灶且病灶乳酸峰升高，肌肉病理可見破碎紅纖維，符合MELAS的診斷；隨病情發(fā)展，12歲出現(xiàn)肌陣攣性癲癇以及小腦性共濟(jì)失調(diào)，提示出現(xiàn)MERRF的表現(xiàn)；而21歲時(shí)又相繼出現(xiàn)意識(shí)障礙、雙側(cè)錐體束征，頭顱MRI顯示對(duì)稱性腦干及基底節(jié)病變，支持Leigh綜合征的臨床和影像學(xué)特點(diǎn)?；颊哐篋NA中檢測到90%的m.8344A>G突變，進(jìn)一步肯定了線粒體病的診斷，臨床診斷為MELAS/MERRF/Leigh重疊綜合征。同時(shí)該患者排除了一氧化碳中毒、低血糖、肝豆?fàn)詈俗冃浴ernicke腦病和甲基丙二酸血癥等其他中毒或代謝性疾病的可能[13]。魏妍平等[14]報(bào)道過1例線粒體NADH脫氫酶3(mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 3，MT-ND3)基因m.10158T>C 突變導(dǎo)致的MELAS/MERRF/Leigh重疊綜合征，并與本文病例有相似的臨床表現(xiàn)，影像學(xué)表現(xiàn)為雙側(cè)中腦和四疊體對(duì)稱性異常信號(hào)。

對(duì)本例患者的長期隨訪發(fā)現(xiàn)其雙側(cè)基底節(jié)異常信號(hào)范圍逐漸縮小，腦干病灶消失。對(duì)于Leigh綜合征的影像學(xué)隨訪研究，Sofou等[15]發(fā)現(xiàn)5/12個(gè)病例的病灶減小或完全消退。在Lee等[16]的報(bào)道中，6/14個(gè)病例的病灶進(jìn)展，沒有病灶完全消退。Bonfante等[4]對(duì)13個(gè)病例進(jìn)行隨訪，3個(gè)患者的實(shí)質(zhì)病灶完全消退，7個(gè)病灶進(jìn)展，包括病灶范圍的擴(kuò)大或新病灶的出現(xiàn)，其中有3個(gè)最初影像學(xué)表現(xiàn)正常的患者，逐漸出現(xiàn)異常病灶。提示Leigh綜合征的影像學(xué)改變也存在異質(zhì)性，病灶可隨時(shí)間進(jìn)展而發(fā)生變化，因其病灶可好轉(zhuǎn)甚至可逆，強(qiáng)調(diào)了積極治療防止其腦損傷的必要性；而早期正常的影像學(xué)表現(xiàn)并不能完全排除Leigh綜合征，如果臨床高度懷疑，需進(jìn)行密切隨訪。

有學(xué)者報(bào)道，線粒體重疊綜合征可能是由共存的兩種線粒體基因突變所導(dǎo)致，如tRNA基因的m.8356T>C和m.3243A>G雙位點(diǎn)致病突變引起的MERRF/MELAS重疊綜合征[17]；m.3243A>G點(diǎn)突變及mtDNA單一大片段缺失導(dǎo)致的MELAS/KSS重疊綜合征[11]。雖然本例患者表現(xiàn)為線粒體腦肌病多個(gè)亞型的重疊綜合征，但進(jìn)一步對(duì)患者mtDNA進(jìn)行全長二代測序，未發(fā)現(xiàn)m.8344A>G以外的致病突變，因此可以認(rèn)為m. 8344 A>G導(dǎo)致了該患者的MELAS/MERRF/Leigh重疊綜合征。

線粒體DNA為雙螺旋的環(huán)狀分子，含16 569個(gè)堿基[18]。線粒體m.8295-m.8364的MT-TK(mitochondrial encoded tRNA lysine)基因編碼賴氨酸t(yī)RNA。因此，m.8344A>G突變可干擾線粒體呼吸鏈的組裝，從而影響呼吸鏈酶復(fù)合體的功能[19]。臨床上，m.8344A>G突變最常引起MERRF綜合征，但也可表現(xiàn)出伴或不伴脂肪瘤的肌病[20]，肢體遠(yuǎn)端無力伴呼吸功能不全[21]，脊髓小腦變性[22]，兒童或成人起病的Leigh綜合征[23-24]、MERRF/Leigh重疊綜合征[9-10]和中樞神經(jīng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的急性脫髓鞘[25]等。本課題組發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致了線粒體腦肌病MELAS/MERRF/Leigh重疊綜合征，進(jìn)一步擴(kuò)展了m.8344A>G的臨床表型。

本例患者血液中有高達(dá)90%的m.8344 A>G的突變比例，盡管患者母親無臨床癥狀，但對(duì)其血液進(jìn)行Sanger測序，也發(fā)現(xiàn)了低比例的相同位點(diǎn)的致病突變[26]。不同于二倍體且遵循孟德爾(Mendelian)遺傳規(guī)律的核基因突變，線粒體基因突變完全為母系遺傳。線粒體DNA多拷貝數(shù)的特性導(dǎo)致了其基因突變的異質(zhì)性，即野生型和突變型mtDNA共存，不同組織可有不同的mtDNA突變水平。只有當(dāng)突變型mtDNA達(dá)到一定比例才引起細(xì)胞代謝功能障礙，即閾值效應(yīng)。各組織對(duì)氧化代謝的需求不同，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、骨骼肌等對(duì)能量需求較高，因此在線粒體疾病中受累明顯[27]。

綜上所述，m.8344A>G可導(dǎo)致MELAS/MERRF/Leigh重疊綜合征。