柳小珍，李瑩瑩，楊麗萍

(北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科， 北京 100191)

遺傳性視網(wǎng)膜變性(inherited retinal dystrophies，IRDs)是一組以進(jìn)行性感光細(xì)胞和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)功能喪失為共同表現(xiàn)的單基因遺傳性致盲眼病。世界范圍內(nèi)IRDs的發(fā)病率為1/3 000～1/2 000[1],根據(jù)是否伴有全身癥狀分為單純性和系統(tǒng)性IRDs，前者主要包括視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、錐桿細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良(cone-rod dystrophies，CORD)、Leber先天性黑朦(Leber congenital amaurosis，LCA)等，后者主要包括Usher綜合征(Usher syndrome，USH)及Bardet-Biedl綜合征等。IRDs種類(lèi)繁多，包含至少20種疾病[1]，截至目前，已報(bào)道的IRDs致病基因已超過(guò)300個(gè)(http://sph.uth.tmc.edu/Retnet/，2019)， 提示IRDs具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性，使得該類(lèi)疾病的診斷困難重重。研究IRDs的致病基因,開(kāi)發(fā)并應(yīng)用相關(guān)的分子診斷技術(shù)是診斷、預(yù)防和治療IRDs的前提條件。近年來(lái)，隨著新一代測(cè)序技術(shù)(即高通量測(cè)序技術(shù))的快速發(fā)展，IRDs的基因診斷逐漸成為臨床診斷不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

基于高通量測(cè)序技術(shù)所開(kāi)發(fā)的各種基因診斷芯片和全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing，WES)是IRDs分子診斷最常用的技術(shù)手段，高通量測(cè)序技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)海量基因片段進(jìn)行平行測(cè)序，高效快速且診斷結(jié)果精確，目前已報(bào)道的各種文獻(xiàn)顯示其診斷率可達(dá)50%以上[2-4]。靶向捕獲芯片以其準(zhǔn)確性高、靈敏性高、運(yùn)營(yíng)成本低等方面的優(yōu)勢(shì)被越來(lái)越多地應(yīng)用到IRDs的分子診斷中[3, 5]。近年來(lái)WES的成本也逐漸降低，且WES還具有發(fā)現(xiàn)單基因遺傳病新致病基因的優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于IRDs的基因診斷中[4, 6]。因而，選用哪種方式為IRDs患者做基因診斷已經(jīng)成為擺在臨床醫(yī)生面前的一道難題。

本研究采用WES和本課題組設(shè)計(jì)并定制的“遺傳性眼病基因診斷芯片”(hereditary eye disease enrichment panel，HEDEP)檢測(cè)IRDs家系的致病基因，以明確遺傳學(xué)診斷，并在本研究范圍內(nèi)對(duì)比WES和HEDEP兩種檢測(cè)方法的差異。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016—2017年在北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科門(mén)診就診的IRDs患者182例，按照就診的時(shí)間順序選取前91例家系的先證者進(jìn)行WES檢測(cè)，選取后91例先證者進(jìn)行HEDEP檢測(cè)，分組時(shí)只考慮時(shí)間因素。記錄患者家族史、婚育史及全身疾病史，繪制家系圖。本項(xiàng)目經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2012093)，征得患者及其家屬同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 全面眼科檢查

患者進(jìn)行眼部檢查，包括最佳矯正視力、裂隙燈顯微鏡檢查、散瞳后眼底檢查、視野、眼底熒光血管造影、視網(wǎng)膜電圖和光學(xué)相干斷層掃描檢查。做基因檢測(cè)之前為所有患者做全面而系統(tǒng)的全身檢查，至少兩位眼科醫(yī)生根據(jù)相同的診斷標(biāo)準(zhǔn)為所有患者做出臨床診斷。招募100例中國(guó)漢族健康人作為對(duì)照。

1.3 基因組DNA提取

抽取患者和家屬外周靜脈血4 mL，EDTA-K2管抗凝，采用全血基因組DNA抽提試劑盒(D3392-02，美國(guó)OMEGA公司)抽提基因組DNA。

1.4 WES

有91位先證者使用Agilent’s SureSelect Human All Exon V5試劑盒(Agilent，Santa Clara，CA，USA)進(jìn)行WES捕獲測(cè)序，該試劑盒可以捕獲20 965個(gè)基因的334 378個(gè)外顯子。捕獲后的DNA經(jīng)擴(kuò)增后使用Illumina Solexa HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 HEDEP

本研究所使用的HEDEP為本課題組設(shè)計(jì)并定制，由美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)(Agilent，Santa Clara，CA，USA)。該芯片能夠同時(shí)捕獲441個(gè)遺傳性眼病致病基因，其中包含291個(gè)與IRDS相關(guān)的致病基因。共有91例IRDs先證者經(jīng)HEDEP捕獲后，在Illumina Solexa HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.6 基因變異分析

182位先證者經(jīng)WES或HEDEP高通量測(cè)序之后，按如下步驟對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析[7]，在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(University of California，Santa Cruz)上獲取參考基因組序列，使用BWA工具將短序列排列組裝成完整的參考基因組，并將其轉(zhuǎn)換成BAM格式，然后使用GATK對(duì)序列進(jìn)行重新排列，減少插入或缺失錯(cuò)誤。隨后，使用Samtools和Picard調(diào)整短序列順序，去掉測(cè)序冗雜信息得到最終的BAM文件，使用Samtools mpileup和bcftools，查找單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymophism，SNPs)及插入或缺失突變(indels)，使用CoNIFER分析拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)，使用ANNOVAR對(duì)SNPs和indels進(jìn)行功能注釋。應(yīng)用千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、ESP 6500、ExAC及SNP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SNPs和indels進(jìn)行分析，排除多態(tài)性位點(diǎn)，確認(rèn)高度可疑的致病變異。最后，使用PolyPhen-2、SIFT、Mutation Taster等在線軟件對(duì)變異進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)分析。

1.7 基因變異分類(lèi)及驗(yàn)證

本研究檢測(cè)到的所有基因變異都根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)和分子病理學(xué)協(xié)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology，ACMG/AMP)制定的《ACMG/AMP變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)與指南》進(jìn)行分類(lèi)，根據(jù)該指南可將基因變異分為五類(lèi)，即“致病的”、“可能致病的”、“意義不明確的”、“可能良性的”和“良性的”基因變異。本研究中不包含“意義不明確的”、“可能良性的”和“良性的”基因變異。使用多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)對(duì)HEDEP檢測(cè)到的CNVs進(jìn)行驗(yàn)證。所有可疑致病位點(diǎn)用 Sanger 測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，用Sequencher軟件對(duì)比分析找出突變位點(diǎn)，在家族成員中進(jìn)行表型-基因型共分離分析，最終確定該家系致病突變。

1.8 RPGR ORF15區(qū)突變的檢測(cè)

RPGR基因是X連鎖遺傳RP最常見(jiàn)的致病基因，該基因上的突變大多位于ORF15區(qū)[8]。由于該區(qū)域結(jié)構(gòu)復(fù)雜，高通量測(cè)序技術(shù)較難覆蓋，因而對(duì)該區(qū)域使用Sanger測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增RPGRORF15區(qū)，正向引物為：5′-CAGAGATCCTATCAGATGACC-3′, 反向引物為：5′-TGTCTGACTGGCCATAATCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 630 bp，選擇4條反向引物進(jìn)行測(cè)序。Sanger 測(cè)序后用 Sequencher 軟件對(duì)比分析找出突變位點(diǎn)，在家族成員中進(jìn)行表型-基因型共分離分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果

本研究包含182例IRDs家系，先證者中男性99例，女性83例；平均年齡34.93歲，最小2歲，最大83歲。根據(jù)最初的臨床診斷可知，本研究共包含9種不同的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病(圖1A)， 最常見(jiàn)的疾病為RP(115例，63.18%)，其他依次為CORD、LCA、USH、Stargard病、Bardet-Biedl綜合征、Bietti結(jié)晶樣視網(wǎng)膜變性(Bietti crystalline corneoretinal dystrophy，BCD)、黃斑變性和無(wú)脈絡(luò)膜癥。有家族史者28例，其中根據(jù)其臨床資料判定為常染色體顯性遺傳者9例(4.95%)、常染色體隱性遺傳者13例(7.14%)、X連鎖遺傳者6例(3.30%)、散發(fā)患者154例(84.61%，圖1B)。

2.2 遺傳學(xué)診斷結(jié)果

本研究使用HEDEP檢測(cè)的確診51例，陽(yáng)性率為56.04%；使用WES檢測(cè)的確診30例，陽(yáng)性率為33.00%；總陽(yáng)性率為44.51%。在81例診斷陽(yáng)性家系中，有3例先證者攜帶常染色體顯性遺傳基因的致病突變，9例先證者攜帶X連鎖遺傳基因的致病突變，其余69例先證者攜帶常染色體隱性遺傳基因的致病突變(圖2)。此次共檢測(cè)到29個(gè)IRDs基因的致病突變(圖2)，其中呈常染色體顯性遺傳的致病基因3個(gè)(分別為RHO、PRPF31和SNRNP200)，呈常染色體隱性遺傳的致病基因24個(gè)，以USH2A最為常見(jiàn)，呈X連鎖遺傳的致病基因2個(gè)(分別為RPGR、RP2)，以RPGR最為常見(jiàn)。

2.2.1散發(fā)病例 本研究有154例散發(fā)病例，包括65例基因診斷陽(yáng)性的病例，其中38例由HEDEP診斷(38/75，50.67%)，27例由WES診斷(27/79，34.18%)，總陽(yáng)性率為42.21%。IRDs散發(fā)病例中通常只有先證者一人發(fā)病，僅根據(jù)臨床病史很難確定該家系的遺傳方式，這增加了臨床遺傳咨詢的難度，基因診斷不僅可以確定該家系的致病基因，還可以根據(jù)致病基因確定遺傳方式。65例散發(fā)病例中，有3例患者攜帶X連鎖遺傳致病基因上的突變，包括RPGR(2例)和RP2(1例)；有1例患者攜帶常染色體顯性遺傳致病基因上的突變，致病基因?yàn)镾NRNP200(新發(fā)突變所致)；其余61例患者攜帶常染色體隱性遺傳致病基因上的突變，涉及的致病基因包括USH2A(19例)和ABCA4(12例)等24個(gè)。

2.2.2常染色體顯性遺傳家系 本研究中通過(guò)臨床資料初步判定9例IRDs家系的遺傳方式為常染色體顯性遺傳(圖1B)，其中基因診斷陽(yáng)性的家系3例，臨床診斷均為RP，因一家系的致病基因?yàn)閁SH2A，將其遺傳方式更正為常染色體隱性遺傳，另外兩家系的致病基因分別為PRPF31和RHO。

2.2.3常染色體隱性遺傳家系 本研究通過(guò)臨床資料初步判定13例IRDs家系的遺傳方式為常染色體隱性遺傳(圖1B)，其中基因診斷陽(yáng)性的家系7例：2例確診為BCD，致病基因?yàn)镃YP4V2；5例確診為RP，致病基因分別為USH2A(1例)、EYS(2例)、RPE65(1例)和CNGA1(1例)。

2.2.4X連鎖遺傳家系 本研究通過(guò)臨床資料初步判定6例IRDs家系的遺傳方式為X連鎖遺傳，基因診斷確診2例CORD家系的致病基因?yàn)镽PGR, 4例RP家系的致病基因分別為RPGR(3例)和RP2(1例)。

2.3 HEDEP和WES的對(duì)比研究

2.3.1HEDEP檢測(cè) 在HEDEP診斷陽(yáng)性的51例IRDs家系中，攜帶復(fù)合雜合突變的家系有32例，攜帶純合突變和半合子突變的各8例，攜帶雜合突變的3例。此次共檢測(cè)到20個(gè)IRDs致病基因上的83個(gè)致病的及可能致病的突變，最常見(jiàn)的3個(gè)致病基因?yàn)锳BCA4(11例)、USH2A(8例)和RPGR(7例)。由HEDEP初次發(fā)現(xiàn)的致病突變共29個(gè)(34.94%)。值得一提的是，HEDEP檢測(cè)到ABCA4基因的一個(gè)CNV，提示HEDEP具有更優(yōu)越地檢測(cè)CNVs的潛力?；颊?，女性，11歲，臨床診斷為Stargard病，HEDEP發(fā)現(xiàn)患者攜帶ABCA4基因雜合突變c.2909C>T(p.T970I)，同時(shí)患者在外顯子38～44(E 38～44)靶向捕獲測(cè)序覆蓋度較其他樣本明顯增加，懷疑存在E 38～44大片段插入突變。Sanger測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)患者攜帶父源ABCA4基因c.2909C>T雜合突變；MLPA驗(yàn)證顯示患者攜帶母源ABCA4基因E 38～44 dup突變(圖3)；HEDEP制備的目標(biāo)基因捕獲探針可準(zhǔn)確捕獲并富集基因，覆蓋441個(gè)遺傳性眼病基因的全部外顯子區(qū)(包含291個(gè)IRDs致病基因)，獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)更具有針對(duì)性。目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度(91例先證者)為414.60；99.44%目標(biāo)區(qū)域≥10×覆蓋度，99.04%目標(biāo)區(qū)域≥20×覆蓋度，97.90%目標(biāo)區(qū)域≥50×覆蓋度(圖4)。

2.3.2WES檢測(cè) WES診斷陽(yáng)性的家系30例，共檢測(cè)出16個(gè)IRDs基因上的50個(gè)致病的及可能致病的突變，最常見(jiàn)的致病基因?yàn)閁SH2A(13例)，USH2A的一個(gè)剪接位點(diǎn)的突變c.8559-2 A>G出現(xiàn)的頻率最高(7次)，該突變?yōu)橐呀?jīng)報(bào)道的致病突變，也是該基因上中國(guó)人群的突變熱點(diǎn)。WES共發(fā)現(xiàn)了24個(gè)新的致病突變(48.00%)，在這24個(gè)突變中，10個(gè)為無(wú)義突變(由點(diǎn)突變或插入缺失突變等導(dǎo)致)。本研究使用的WES試劑盒可覆蓋幾乎所有基因的外顯子編碼區(qū)，目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度(91例先證者)為79.00，99.22%目標(biāo)區(qū)域≥10×覆蓋度，97.23%目標(biāo)區(qū)域≥20×覆蓋度，73.16%目標(biāo)區(qū)域≥50×覆蓋度(圖4)。

綜上，分別檢測(cè)兩組相同數(shù)量的IRDs患者，HEDEP陽(yáng)性率明顯高于WES。在平均測(cè)序深度以及測(cè)序覆蓋度方面，HEDEP優(yōu)于WES，尤其在50×和100×以上覆蓋度方面HEDEP較WES的優(yōu)勢(shì)更加明顯(圖4)，且HEDEP具有檢測(cè)CNVs的潛力。

2.4 表型-基因型對(duì)應(yīng)關(guān)系分析

患者2，男性，38歲，自幼夜盲，近20年來(lái)中心視力逐漸下降，臨床診斷為RP，基因診斷結(jié)果顯示患者攜帶CEP290基因復(fù)合雜合突變c.7332_7333 insAGAAG(p.V2445Rfs*3)和c.367 C>T(p.Q123*)。c.367 C>T(p.Q123*)已被報(bào)道為L(zhǎng)CA的致病突變[9]，c.7332_7333 insAGAAG(p.V2445Rfs*3)為本研究新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)。CEP290基因是多種常染色體隱性遺傳IRDs的致病基因，如LCA、Senior-Loken綜合征、Joubert綜合征等。有文獻(xiàn)報(bào)道CEP290上的致病突變可導(dǎo)致RP[3]，該患者就診時(shí)表現(xiàn)出典型的RP癥狀，如夜盲、進(jìn)行性視力喪失及典型的RP眼底改變(圖5)，因而確定其診斷為由CEP290基因突變引起的常染色體隱性遺傳RP。

患者3，男性，45歲，自幼夜盲，近15年中心視力逐漸下降直至失明。眼底彩照表現(xiàn)為典型的晚期RP改變，基因診斷結(jié)果顯示患者攜帶CYP4V2基因復(fù)合雜合致病突變c.214+1G>T和c.1091-2 A>G，均為人類(lèi)基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)(human gene mutation database，HGMD)收錄的致病突變，HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)顯示c.214+1G>T可導(dǎo)致RP，該位點(diǎn)的另一個(gè)突變c.214+1G>A可導(dǎo)致BCD[10]，而c.1091-2 A>G可導(dǎo)致BCD[11]，因此,將該患者診斷為晚期BCD患者(圖6)。

3 討論

本研究收集182例IRDs家系，各家系按時(shí)間順序分別接受WES和HEDEP檢測(cè)，共檢測(cè)到29個(gè)IRDs基因上的致病突變，其中最常見(jiàn)的3個(gè)致病基因?yàn)閁SH2A、ABCA4及RPGR，在眾多的致病突變中，有43個(gè)突變尚未見(jiàn)其他研究報(bào)道，此外，還發(fā)現(xiàn)6個(gè)家系攜帶RPGRORF15突變。通過(guò)對(duì)比HEDEP和WES在兩組患者基因診斷中的數(shù)據(jù)，提示HEDEP是IRDs患者進(jìn)行初次基因診斷的首選。

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，分子診斷逐漸成為IRDs診斷和分類(lèi)的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示，HEDEP基因診斷陽(yáng)性率高于WES(56.04%vs. 33.00%)，提示HEDEP應(yīng)當(dāng)作為IRDs臨床基因診斷的首選方案，HEDEP篩選時(shí)認(rèn)為可能由新的致病基因變異導(dǎo)致的IRDs病例，可選用WES進(jìn)行后續(xù)研究。

與WES相比，HEDEP有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：第一，HEDEP的測(cè)序深度和覆蓋度明顯高于WES，這意味著HEDEP的診斷結(jié)果更精確可靠；Consugar等[12]采用基因靶向捕獲芯片(GEDi，可捕獲257個(gè)遺傳性眼病基因)對(duì)192例IRDs先證者進(jìn)行基因診斷，為了分析GEDi和WES在IRDs診斷應(yīng)用中的優(yōu)劣，在這192例先證者中隨機(jī)選出4例(1例作為參照)進(jìn)行WES檢測(cè)，采用相同的度量標(biāo)準(zhǔn)分析GEDi和WES的測(cè)序數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，GEDi對(duì)于單核苷酸突變的檢測(cè)敏感性和特異性分別為97.6%和100%，而WES對(duì)于單核苷酸突變的檢測(cè)敏感性僅為88.3%，明顯低于前者(WES的測(cè)序覆蓋度明顯低于前者所致)，該課題組經(jīng)過(guò)計(jì)算精確地證明了基因靶向捕獲芯片的測(cè)序結(jié)果較WES更精確。第二，HEDEP靶向捕獲特定數(shù)量的區(qū)域，測(cè)序深度高，樣本之間差異小，該方法可較敏感地捕捉到CNVs導(dǎo)致的測(cè)序覆蓋度的改變，提示CNVs的存在，這也是HEDEP的較大優(yōu)勢(shì)。而WES則不同，應(yīng)用WES數(shù)據(jù)難以準(zhǔn)確檢測(cè)CNVs，通過(guò)查閱HGMD的最新數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)可知，CNVs是IRDs的重要致病因素[13]。實(shí)際應(yīng)用中如果選用WES進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)患者攜帶某些常染色體隱性遺傳基因的雜合突變時(shí)，可考慮結(jié)合使用MLPA檢測(cè)該基因上的CNVs[14-15]，以提高基因診斷陽(yáng)性率。第三，某些致病基因上的變異發(fā)生于深內(nèi)含子區(qū)域，應(yīng)用WES難以覆蓋，但可以加入到HEDEP捕獲區(qū)域，以增加HEDEP的陽(yáng)性率。第四，WES會(huì)產(chǎn)生數(shù)以萬(wàn)計(jì)的海量數(shù)據(jù)[16]，很難在如此之多的數(shù)據(jù)中分析出患者的致病突變位點(diǎn)，雖然目前計(jì)算技術(shù)高度發(fā)達(dá)，但仍有許多應(yīng)用限制，相反，HEDEP有針對(duì)性地檢測(cè)441個(gè)遺傳性眼病基因，分析起來(lái)更加容易，結(jié)果也會(huì)更可靠。第五，HEDEP價(jià)格僅為WES的一半，且后續(xù)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)成本不高，適用于臨床大樣本檢測(cè)。

WES也有HEDEP所不具備的優(yōu)點(diǎn)，HEDEP和WES均能發(fā)現(xiàn)已知致病基因上的突變，但WES能夠發(fā)現(xiàn)新的致病基因，ACMG推薦其他基因診斷方法結(jié)果陰性的家系使用WES，可作為其他基因診斷方法的補(bǔ)充手段[17]。與連鎖分析不同，HEDEP和WES等高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)患者的家族史和家系中患病成員數(shù)量并無(wú)要求，可為散發(fā)病例提供準(zhǔn)確的致病基因診斷，進(jìn)而提供遺傳咨詢等方面的幫助。為了就IRDs的臨床分子診斷工作給眼科醫(yī)師提供一些可行性建議，我們將各檢測(cè)手段選擇順序繪成流程圖(圖7)。

本研究發(fā)現(xiàn)USH2A和ABCA4兩個(gè)基因的突變頻率分別為11.54%(21/182)和6.59%(12/182)，RPGR基因的突變頻率為3.85%(7/182)，是中國(guó)IRDs患者中最常見(jiàn)的致病基因。目前，IRDs沒(méi)有有效的治療方法，產(chǎn)前預(yù)防是最好的干預(yù)手段，特別是對(duì)于散發(fā)家系，沒(méi)有明確的基因診斷，下一代再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和遺傳學(xué)咨詢也無(wú)從談起。本研究發(fā)現(xiàn)了43個(gè)新的致病突變，涉及家系共41例，為這些家系的遺傳咨詢及產(chǎn)前預(yù)防提供了可能，新致病突變的發(fā)現(xiàn)還豐富了突變頻譜，為統(tǒng)計(jì)中國(guó)漢族人群突變熱點(diǎn)提供了便利，是基因治療方案研發(fā)的基礎(chǔ)。此外，基因診斷亦發(fā)現(xiàn)新的表型-基因型對(duì)應(yīng)關(guān)系，以往報(bào)道CEP290基因是LCA及IRDs的致病基因，本研究中該基因變異也可導(dǎo)致RP，進(jìn)一步豐富了該基因的表型。

BCD在中國(guó)人群中較為多見(jiàn)，眼底彩照呈現(xiàn)出3個(gè)階段的改變，第一階段主要表現(xiàn)為RPE萎縮，大量閃亮的黃白色結(jié)晶顆粒集中于后極部或遍布整個(gè)視網(wǎng)膜，也是多數(shù)BCD患者典型的眼底改變；第二階段RPE萎縮蔓延至整個(gè)后極部并伴后極部脈絡(luò)膜萎縮；第三階段RPE及脈絡(luò)膜萎縮蔓延整個(gè)眼底[18]，黃白色結(jié)晶樣物質(zhì)沉積反而不典型，患者3的眼底改變即處于第三階段，臨床診斷易與RP混淆，基因診斷為確診的有效途徑。BCD是一種進(jìn)展性疾病，但也受環(huán)境因素影響[19]，許多患者伴有脂質(zhì)代謝異常，提示高脂飲食可能加劇疾病進(jìn)展，基因檢測(cè)可明確BCD的診斷，此時(shí)指導(dǎo)患者飲食將有益于預(yù)后。

本研究中尚有101例患者未能確診致病基因，分析原因主要有：(1)HEDEP及WES均無(wú)法100%覆蓋所有目標(biāo)區(qū)域；(2)無(wú)法檢測(cè)到基因深部?jī)?nèi)含子區(qū)及基因調(diào)控區(qū)的突變；(3)WES無(wú)法檢測(cè)CNVs；(4)某些家系可能由新的致病基因上的突變所致。未來(lái)工作中需要結(jié)合使用其他測(cè)序方法(如全基因組測(cè)序)以提高陽(yáng)性率[5, 20]。

綜上所述，本研究證實(shí)HEDEP是一種快速高效的基因診斷手段，應(yīng)當(dāng)作為IRDs基因檢測(cè)的首選方法，WES可作為補(bǔ)充方法；本研究發(fā)現(xiàn)了43個(gè)新的突變位點(diǎn)，豐富了IRDs基因的突變頻譜，為將來(lái)IRDs基因診斷、遺傳咨詢和基因治療奠定了基礎(chǔ)。

(志謝： 感謝所有參與患者及其家屬的積極配合。)