周 迪，陳章健，胡貴平，閻騰龍，龍昌茂，馮慧敏，賈 光

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系， 北京 100191)

二氧化鈦(titanium dioxide, TiO2)，俗稱“鈦白粉”，在食品工業(yè)中常作為著色劑用于口香糖、糖果、甜點(diǎn)、沙拉醬等食品[1-2]，其中，納米TiO2(三維尺度中至少有一維的直徑<100 nm)由于具有更加出色的遮蓋能力，在食品添加領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[3-4]。兒童因喜甜食是納米TiO2的高暴露人群，根據(jù)Rompelberg等[5]的研究，兒童(≤6歲)納米TiO2的暴露量約為成人的4倍，兒童每日納米TiO2的97.5%分位數(shù)暴露量(有97.5%的兒童每日暴露量低于此值)約為4.16 μg/kg(95%CI：3.84～4.52 μg/kg)。

與常規(guī)尺寸相比，納米TiO2具有獨(dú)特的理化特性(如小尺寸效應(yīng)、更大的比表面積、量子限域效應(yīng)等)，生物吸收、分布特點(diǎn)和安全效應(yīng)也隨之改變[6-7]。近年的體外試驗(yàn)研究顯示，納米TiO2暴露可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基升高、氧化還原狀態(tài)失衡，最終引發(fā)炎性反應(yīng)及線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8-10]。體內(nèi)研究顯示，納米TiO2經(jīng)口暴露后，約有0.06%經(jīng)消化道吸收，其余以原型經(jīng)消化道直接排出，吸收入血的納米TiO2可快速分布于肝、脾，并在其中蓄積，肝臟中納米TiO2的90天清除率約為20%～26%[11]。然而，目前有關(guān)納米TiO2經(jīng)口暴露后對(duì)體內(nèi)多組織、臟器氧化/抗氧化標(biāo)志及炎性因子影響的系統(tǒng)研究依然十分有限。

小腸和大腸是納米TiO2經(jīng)口暴露時(shí)的直接接觸器官，血液、組織是納米二氧化鈦吸收后分布、轉(zhuǎn)運(yùn)的主要媒介，肝臟是納米二氧化鈦經(jīng)口暴露后的主要蓄積器官。為了更加系統(tǒng)和全面地評(píng)估納米TiO2經(jīng)口暴露后對(duì)各組織、臟器的氧化/抗氧化標(biāo)志物及炎性因子的影響，本研究對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃染毒，檢測(cè)血清、肝、小腸和大腸中的氧化/抗氧化標(biāo)志和炎性因子變化，分析比較各組織、臟器的改變模式差異，以期為深入、系統(tǒng)地預(yù)測(cè)、評(píng)估納米TiO2經(jīng)口暴露對(duì)不同組織、臟器的損傷效應(yīng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

納米級(jí)TiO2[銳鈦礦型，(25±5) nm]購(gòu)于上海麥克林試劑有限公司，微量總巰基(total mercapto, T-SH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，丙二醛檢測(cè)試劑盒(malomdialdehvde, MDA, TBA法)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH, DTNB速率法)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒購(gòu)于北京雷根生物技術(shù)有限公司，氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide, GSSG)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid assay, BCA法)蛋白定量試劑盒購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司，白細(xì)胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子受體-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2 納米TiO2顆粒的理化表征

應(yīng)用場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM，Tecnai F30，美國(guó)FEI公司)對(duì)納米TiO2的形貌和粒徑進(jìn)行觀察，應(yīng)用Image J軟件(Version 1.8.0_112，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)統(tǒng)計(jì)TEM圖像中200個(gè)納米TiO2顆粒的平均費(fèi)雷特粒徑(Feret diameter)，應(yīng)用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡配套的X射線能譜分析儀(energy dispersive X-ray spectroscopy, EDS, Nova_NanoSEM430，美國(guó)FEI公司)定量測(cè)定納米TiO2中元素組成及含量。應(yīng)用X射線衍射物相結(jié)構(gòu)分析儀(X-ray powder diffractometer, XRD, X-Pert3 Powder, 荷蘭PANalytical公司)測(cè)定納米TiO2的晶型及含量，測(cè)定結(jié)果采用match(Version 3.6.2.121，美國(guó)路易斯安納Ochsner健康系統(tǒng))軟件進(jìn)行晶型鑒定及定量分析。

1.3 動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只(4周齡)， 體質(zhì)量63～81 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2016-001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(京)2016-0041]，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按照體質(zhì)量將大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，分籠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)(室溫22～24 ℃，濕度60%～70%，光照12/12 h明暗交替)。在第7、14、21、28和29(處死前)天記錄大鼠體質(zhì)量，在每周第1、4天稱取每籠進(jìn)食量，并依據(jù)間隔天數(shù)計(jì)算相鄰兩次稱量期間每只大鼠的日平均進(jìn)食量。

為了讓使用的染毒劑量能反映絕大多數(shù)兒童納米TiO2的暴露情況，本研究選取荷蘭膳食調(diào)查中每日納米TiO2攝入P95：4.52 μg/kg體質(zhì)量與西歐國(guó)家平均納米TiO2暴露差異倍數(shù)4.5相乘得到每天20.34 μg/kg體質(zhì)量，最終選取20 μg/kg體質(zhì)量作為97.5%兒童納米TiO2暴露的估計(jì)值[5,12]，以100為安全系數(shù)，以5為組距，得低、中、高劑量組染毒濃度分別為2、10、50 mg/kg體質(zhì)量。

對(duì)照組大鼠每日用1 mL超純水灌胃，低、中、高劑量組用超純水分別稀釋含納米TiO2濃度為0.4 g/L、2.0 g/L和10.0 g/L的母液，依據(jù)每只大鼠體質(zhì)量，在每次染毒前分別配置1 mL相應(yīng)劑量的染毒液。每日灌胃前將染毒液超聲分散30 min，渦旋混勻30 s。灌胃染毒持續(xù)28 d，經(jīng)過(guò)12 h禁食不斷水后，以10%(體積分?jǐn)?shù))水合氯醛(0.4 mL/100 g體質(zhì)量)麻醉，腹主動(dòng)脈取血后斷髓法處死大鼠，摘取臟器稱重并保存。

1.4 ELISA及微板法檢測(cè)氧化損傷及炎性指標(biāo)

促凝血在4 ℃下3 000 r/min離心10 min后取血清。肝、大腸及小腸稱重后取0.10 g組織加入1.0 mL 生理鹽水進(jìn)行勻漿，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作規(guī)程對(duì)相應(yīng)氧化/抗氧化指標(biāo)、炎性因子進(jìn)行測(cè)定。采用掃描式多功能讀數(shù)儀(VARIOSKAN FLASH，美國(guó)Thermo公司)讀取氧化/抗氧化因子和炎性因子的檢測(cè)結(jié)果，采用Sigma 3-30K低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)進(jìn)行離心。各指標(biāo)采用BCA蛋白對(duì)結(jié)果校正后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，除GSH/GSSG是兩個(gè)指標(biāo)物質(zhì)的量比無(wú)量綱外，其余指標(biāo)均為組織、臟器中每1 mg BCA蛋白對(duì)應(yīng)的量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2016、R 3.5.1及SPSS 24.0整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)±四分位數(shù)間距表示。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法檢測(cè)整體差異，且Levene檢驗(yàn)組間方差齊的數(shù)據(jù)用Dunnett 法對(duì)組間差異進(jìn)行兩兩比較，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3法進(jìn)行組間兩兩比較，正態(tài)分布不滿足的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis法(使用bonferroni法校正多重比較P值)進(jìn)行非參數(shù)差異檢驗(yàn)和后續(xù)的組間兩兩比較，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米TiO2的理化表征

本研究應(yīng)用透射電鏡觀察納米TiO2顆粒的形貌和粒徑分布(圖1A)，TiO2顆粒多呈球型，表面光滑，平均粒徑(Feret diameter)為(25.12±5.64) nm(圖1B)。EDS結(jié)果見(jiàn)圖1C，由圖譜定量分析可見(jiàn)，顆粒物中鈦元素質(zhì)量占比約為66.98%±0.51%，氧元素質(zhì)量占比約為33.02%±0.61%，納米TiO2的純度超過(guò)99.99%。XRD結(jié)果顯示(圖1D)，納米TiO2晶型主要為銳鈦礦(anatase)，含量為100.0%，上述理化特征與產(chǎn)品標(biāo)簽內(nèi)容一致。

2.2 納米TiO2對(duì)體質(zhì)量、進(jìn)食及臟器系數(shù)的影響

高、中、低劑量組大鼠體質(zhì)量變化見(jiàn)圖2，日均進(jìn)食量變化見(jiàn)圖3，臟器系數(shù)見(jiàn)表1，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量和臟器系數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 納米TiO2對(duì)氧化/抗氧化生物標(biāo)志的影響

連續(xù)經(jīng)口灌胃染毒28 d后，各組大鼠血清、肝、小腸和大腸的氧化/抗氧化生物標(biāo)志見(jiàn)表2。

2.3.1氧化還原相關(guān)酶 與對(duì)照組相比，高劑量組血清中SOD活力顯著上升(P=0.009)，肝、小腸和大腸的SOD活力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比，高、中、低劑量組血清、肝、大腸和小腸中的GSH-Px活力的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.2抗氧化指標(biāo) 與對(duì)照組相比，高、中、低劑量組血清、肝、大腸和小腸中的GSH濃度、T-SH濃度以及GSH和GSSG的摩爾濃度比值(GSH/GSSG)在血清、肝、小腸、大腸中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.3氧化指標(biāo) 與對(duì)照組相比，中劑量組小腸中GSSG濃度顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)，高劑量組小腸中GSSG濃度顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)；高、中、低劑量組GSSG濃度在血清、肝和大腸中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，低劑量組肝MDA濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042)，中劑量組肝MDA濃度有升高趨勢(shì)(升高9%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量組肝MDA濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)；血清、小腸和大腸中MDA濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 納米TiO2對(duì)炎性因子影響

炎性因子改變見(jiàn)表3，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組血清、肝、小腸、大腸中IL-6濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低劑量組肝中TNF-α濃度有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中劑量組肝中TNF-α顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，高劑量組TNF-α顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)，不同劑量組間TNF-α濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

表1 不同劑量組臟器系數(shù)Table 1 Organ weights coefficients of rats in different dose groups mg/g

表2 納米TiO2染毒后對(duì)多組織氧化/抗氧化生物標(biāo)志的影響Table 2 Effects of TiO2 nanoparticles on oxidation/antioxidation biomarkers in multiple tissues

SOD和GSH-Px是機(jī)體清除過(guò)氧化物、保護(hù)其他氧化還原敏感位點(diǎn)、減少氧化損傷的重要抗氧化酶。SOD是機(jī)體唯一可以特異性催化清除超氧化物(O22-)轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫的抗氧化酶[16]，與對(duì)照組相比，本研究中觀察到高劑量組血液組織中SOD活性升高，與Huang等[17]觀察到的納米TiO2經(jīng)口急性染毒(10 mg/L, 4 d)后，導(dǎo)致幼年牙鲆魚(yú)(Paralichthysolivaceus, 俗稱比目魚(yú))SOD活力上升一致，提示納米TiO2暴露后出現(xiàn)了自由基增加。GSH-Px可以催化由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸構(gòu)成的還原性三肽GSH，將GSH氧化為GSSG的同時(shí)還原機(jī)體中的H2O2、脂過(guò)氧化物等。本研究中各劑量組在各組織、臟器中的GSH濃度、GSH-Px、GSH/GSSG與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、高劑量組可見(jiàn)小腸中GSSG含量顯著增高，但是GSH/GSSG相比對(duì)照組未見(jiàn)顯著差異，提示納米TiO2暴露可以造成更多GSH被氧化，但是GSH與GSSG的比例依然處在機(jī)體代償范圍之內(nèi)[18]。T-SH是蛋白質(zhì)參與氧化還原時(shí)最易被氧化的敏感位點(diǎn)，主要包含GSH所含-SH和其余各類蛋白質(zhì)所含-SH兩部分，后者對(duì)于蛋白維持構(gòu)象、發(fā)揮生物活性具有重要意義，含-SH的分子改變可能導(dǎo)致炎性反應(yīng)激活[14-15]，炎性因子升高。本研究中各組T-SH、GSH濃度在各臟器中均未見(jiàn)顯著差異，提示各劑量組中，納米TiO2對(duì)GSH以外的含-SH的生物分子的氧化作用與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。

表3 納米TiO2暴露對(duì)多組織炎性因子的影響Table 3 Effects of TiO2 nanoparticles on inflammatory cytokine in multiple tissues

MDA是活性氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸分子形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，可以反映機(jī)體生物膜結(jié)構(gòu)受氧化損傷的程度，本研究中低劑量組和高劑量組肝MDA濃度與對(duì)照組相比顯著上升，提示納米TiO2染毒后可能誘導(dǎo)低劑量組和高劑量組的肝臟出現(xiàn)了脂質(zhì)過(guò)氧化。本研究中觀察到氧化產(chǎn)物及炎性因子濃度顯著增加，與Hu等[19]報(bào)道的納米TiO2灌胃(64、320 mg/kg體質(zhì)量, 14周)導(dǎo)致小鼠肝MDA等氧化產(chǎn)物及炎性因子TNF-α顯著增加一致，與Cui等[13]用5、10、50 mg/kg 納米TiO2灌胃染毒小鼠60 d，觀察到5 mg/kg組MDA濃度和SOD mRNA表達(dá)量未出現(xiàn)顯著改變，10 mg/kg和50 mg/kg組小鼠MDA和SOD mRNA表達(dá)量出現(xiàn)顯著改變的結(jié)果一致。

本研究中未觀察到抗氧化物質(zhì)的顯著下降，僅觀察到氧化產(chǎn)物GSSG和MDA增加，抗氧化酶SOD活性上升，與Shukla等[20]用10、50、100 mg/kg納米TiO2經(jīng)口染毒小鼠14 d的研究發(fā)現(xiàn)一致，該研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10 mg/kg染毒組的ROS含量、GSH含量及MDA含量均未出現(xiàn)顯著差異，50 mg/kg染毒組的GSH含量依然未出現(xiàn)顯著改變，100 mg/kg染毒組的GSH含量顯著下降，50、100 mg/kg組MDA含量均顯著升高，提示MDA可能比GSH對(duì)TiO2經(jīng)口暴露所致氧化/抗氧化改變更加敏感，較高濃度納米TiO2染毒后可觀察到GSH濃度顯著改變。本研究中觀察到的GSSG含量增加，但GSH含量與GSH/GSSG在2～50 mg/kg保持不變與Shukla等[20]觀察到的納米TiO2劑量10～50 mg/kg灌胃染毒時(shí)GSH濃度不變、100 mg/kg染毒時(shí)GSH濃度改變的結(jié)果相一致，此現(xiàn)象可能與Gornati等[21]觀察到的納米TiO2暴露后引起的SOD、GSH的轉(zhuǎn)錄、翻譯代償性升高機(jī)制有關(guān)，增加的SOD及GSH可將納米TiO2經(jīng)口暴露產(chǎn)生的活性氧自由基還原，保障GSH與GSSG的氧化/抗氧化平衡，從而保護(hù)其他生物分子。

TNF-α和IL-6均為具有促炎作用的細(xì)胞炎性因子，TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)血中C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A等急性時(shí)相反應(yīng)蛋白的產(chǎn)生，引發(fā)炎性反應(yīng)。與對(duì)照組相比，中劑量組和高劑量組均觀察到肝TNF-α濃度顯著升高，提示中劑量組和高劑量組出現(xiàn)了炎性反應(yīng)，與Chen等[22]前期研究報(bào)道的納米TiO2經(jīng)口暴露(0～50 mg/kg體質(zhì)量，30 d)導(dǎo)致SD大鼠TNF-α升高一致。本研究?jī)H觀察到各劑量組IL-6濃度有上升趨勢(shì)，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究中測(cè)定的IL-6個(gè)體波動(dòng)水平較大，得到結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差較大有關(guān)。

對(duì)不同劑量組大鼠肝、血液組織、小腸和大腸的氧化/抗氧化生物標(biāo)志物和炎性因子改變進(jìn)行分析結(jié)果顯示，不同劑量納米TiO2暴露均未造成各組織的還原性物質(zhì)含量發(fā)生顯著改變，納米TiO2染毒后可觀察到抗氧化酶SOD活性顯著升高、氧化產(chǎn)物GSSG和MDA的含量顯著升高、促炎因子TNF-α含量顯著升高。各劑量組出現(xiàn)顯著改變指標(biāo)的個(gè)數(shù)由高到低依次為：高劑量組>中劑量組>低劑量組，出現(xiàn)顯著改變的指標(biāo)個(gè)數(shù)呈現(xiàn)出隨劑量增高而增加的趨勢(shì)，且與對(duì)照組相比，低劑量組僅觀察到氧化產(chǎn)物顯著改變，中劑量組觀察到氧化產(chǎn)物和炎性因子的改變，高劑量組同時(shí)觀察到氧化產(chǎn)物、炎性因子和氧化還原酶活性的改變，提示納米TiO2經(jīng)口暴露后，對(duì)大鼠氧化/抗氧化生物標(biāo)志以及炎性因子的影響有隨劑量增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)。

對(duì)不同臟器出現(xiàn)顯著改變的指標(biāo)進(jìn)行分析比較結(jié)果顯示，納米TiO2染毒后，對(duì)血液組織、肝、小腸、大腸造成的影響不同，與對(duì)照組相比，大腸中各劑量組指標(biāo)改變均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血液組織中可見(jiàn)高劑量組SOD活性升高，小腸中可見(jiàn)低、高劑量組氧化產(chǎn)物GSSG增加，肝中可觀察到低、高劑量組氧化產(chǎn)物GSSG和MDA增加，中、高劑量組炎性因子TNF-α增加。各個(gè)組織、臟器發(fā)現(xiàn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變指標(biāo)數(shù)由高到低依次為：肝>小腸>血液組織>大腸，且在血液組織中僅觀察到抗氧化酶SOD活性的變化，在小腸中觀察到氧化產(chǎn)物GSSG顯著上升，在肝中同時(shí)觀察到炎性因子和氧化指標(biāo)出現(xiàn)顯著改變，提示亞急性經(jīng)口暴露下，主要蓄積器官肝對(duì)納米TiO2誘導(dǎo)的氧化/抗氧化生物標(biāo)志和炎性因子變化最為敏感，其次是小腸和血液組織，大腸最不敏感。此結(jié)果與Sycheva等[23]用納米TiO2經(jīng)口灌胃染毒小鼠后發(fā)現(xiàn)的肝組織出現(xiàn)顯著氧化型損傷而大腸組織中未出現(xiàn)顯著性氧化損傷一致。上述結(jié)果提示，在接下來(lái)的研究中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注納米TiO2對(duì)肝等主要蓄積器官的毒作用。

綜上所述，納米TiO2亞急性經(jīng)口暴露后可導(dǎo)致大鼠肝、小腸和血液組織的氧化/抗氧化生物標(biāo)志出現(xiàn)顯著改變，可誘導(dǎo)肝臟炎性因子升高，其中，肝對(duì)納米TiO2誘導(dǎo)的氧化/抗氧化生物標(biāo)志改變最為敏感，隨后依次為小腸和血液組織，大腸最不敏感。氧化/抗氧化生物標(biāo)志及炎性因子的改變，是多種疾病的早期標(biāo)志，對(duì)于預(yù)測(cè)、評(píng)估納米TiO2經(jīng)口暴露的潛在毒效應(yīng)具有一定的提示作用，然而，對(duì)暴露后各組織、臟器具體的損傷情況仍有待通過(guò)組織病理學(xué)檢查等方法進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

(志謝：感謝北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系的趙琳、劉佳興、張永亮，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部以及北京大學(xué)分析測(cè)試中心的各位老師在本實(shí)驗(yàn)中給予的幫助與指導(dǎo)。)