武小芬 陳 亮 齊 慧 張 勇 周毅吉 鄧 明 王克勤

(湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所/湖南省農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410125)

油茶殼(Camellia oleifera shell)是油茶籽果實外種皮，占茶果干重的30.16%～34.10%，其殼富含木質(zhì)素、木聚糖和纖維素，含量分別為42.21%、27.50%和19.87%[1-2]，常作為工業(yè)原料，用來制備活性炭[3]、木糖[3]、糠醛[4]、木糖醇[5]和膳食纖維[6]等。油茶殼中富含的木質(zhì)纖維素成分，將其分離后進行高值化利用，不僅可以提高油茶殼的利用效率，同時也能夠促進油茶產(chǎn)業(yè)的增值。

目前，有機溶劑分離法因其環(huán)境友好、成本投入低和溶劑回收率高等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)木質(zhì)纖維素組分分離[7-8]。相比醇類，有機酸如甲酸和乙酸可以很好地溶解木質(zhì)素，且在常壓、相對較低溫度(＜110℃)就能獲得較好的分離效果[9-10]。何偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)棉稈在80%甲酸反應(yīng)體系中，90℃反應(yīng)3 h，木質(zhì)素得率為55.7%。Snelders 等[12]研究發(fā)現(xiàn)小麥秸稈在甲酸∶乙酸∶水(體積比3∶5.5∶1.5)組成的反應(yīng)體系中，105℃反應(yīng)3 h，纖維素得率和純度分別為48%和63%，木質(zhì)素脫除率達98%。Shui 等[7]研究發(fā)現(xiàn)玉米秸稈在甲酸∶乙酸∶水(體積比6∶3∶1)反應(yīng)體系中，90℃反應(yīng)180 min，纖維素得率為53%、純度為85%，木質(zhì)素得率為38%、純度為44%。上述研究均表明甲酸能夠有效分離生物質(zhì)中的纖維素和木質(zhì)素，但得率或純度有待進一步提高。因此，本研究結(jié)合其他的預(yù)處理方法，先破壞木質(zhì)纖維素的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，有利于提高分離效率。

高能射線(γ 射線、電子束)輻照處理可以破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，使多糖鏈發(fā)生斷裂，形成羧基和醛基[13]。輻照產(chǎn)生的這些弱酸性基團在水溶液條件下可以催化木質(zhì)纖維素進一步斷鏈解聚，若將其應(yīng)用于木質(zhì)纖維素組分分離的預(yù)處理具有很好的效果。Zhou等[14]采用γ-戊內(nèi)酯和水組成的溶劑體系(40∶60，m∶m)分離800 kGy 輻照處理的蘆葦桿木質(zhì)纖維素，于170℃反應(yīng)1 h，纖維素提取率和純度分別為83%和86%，木質(zhì)素和半纖維素的去除率分別為90%和97%。武小芬等[15]研究了輻照協(xié)同甲酸分離玉米芯纖維素、木質(zhì)素和木糖，結(jié)果表明400 kGy 輻照處理玉米芯，采用甲酸分離的木質(zhì)素和纖維素純度分別較對照提高16.11%和14.53%，木糖得率提高41.10%。以上研究均說明協(xié)同輻照處理可以提高木質(zhì)纖維素各組分的分離效果。為了提高甲酸分離油茶殼木質(zhì)纖維素的提取率和純度，本試驗在上述研究基礎(chǔ)上以輻照處理后的油茶殼為材料，系統(tǒng)研究不同輻照劑量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對甲酸一步分離油茶殼纖維素、木糖和木質(zhì)素得率和純度的影響，旨在得出輻照協(xié)同甲酸分離油茶殼木質(zhì)纖維素的最佳工藝，為油茶殼全組分生物煉制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶殼由湖南大三湘茶油有限公司提供，自然晾干后儲存于陰涼干燥環(huán)境中，備用。葡萄糖、木糖、纖維二糖均為標(biāo)準(zhǔn)品，購于美國Sigma 公司；甲酸、硫酸均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；試驗用水為去離子水。

1.2 主要儀器與設(shè)備

輻射源活度2.96×1016Bq60Co-γ 輻照裝置，湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所；FW177 高速粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；JJ-6 恒速攪拌器，江蘇金儀儀器科技有限公司；DZKW-s-4 電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；GZX-9246 電熱鼓風(fēng)干燥箱、SHZ-C 水浴恒溫振蕩器、YXQ-50SII 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BlueStar A 紫外分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UltiMate 3000高效液相色譜，美國賽默飛世爾科技有限公司；Eco-S15純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 輻照處理 將1 kg 油茶殼原料裝于金屬箱(20 cm×20 cm×40 cm)中，室溫下進行動態(tài)輻照處理，輻射源活度2.96×1016Bq。樣品輻照劑量分別為0(對照)、200、400、600、800 kGy。

1.3.2 機械粉碎 分別取經(jīng)不同劑量輻照處理后的油茶殼進行粉碎，每次投料200 g，粉碎15 s，收集顆粒小于40 目的樣品，稱重。按照公式計算獲得1 kg 過40 目篩的油茶殼粉末所需粉碎能耗(kWh):

式中，m 為粉碎后獲得過40 目篩油茶殼粉末，質(zhì)量1 000 g；m40為每200 g 油茶殼粉碎后過40 目篩樣品質(zhì)量，g；t 為粉碎時間(15/3 600)，h；P 為儀器功率，1.2 kW。

1.3.3 油茶殼成分分析 水分含量測定:參照國標(biāo)GB 5009.3-2016[16]。

水溶性成分測定:稱取2.0 g(精確至0.000 1 g)樣品，按固液比1∶30(g·mL-1)加60 mL 蒸餾水于三角瓶中，于50℃、130 r·min-1條件下水浴反應(yīng)2 h，抽濾，濾渣用少量蒸餾水沖洗3 次，105℃烘干至恒重，合并濾液和沖洗液，定容至100 mL(即為水浸出液)，用于分析水溶性單糖和多糖的含量。

式中，m1為樣品干重；m2為水洗后殘渣干重。

纖維素、木聚糖和木質(zhì)素含量測定:參照美國國際可再生能源實驗室的分析方法[17]。

葡萄糖和木糖含量采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定[17]，色譜條件為:Aminex HPX-87H(7.8 mm×300 mm)色譜柱，流動相為0.005 mol·L-1H2SO4溶液，流速0.6 mL·min-1，示差折光檢測器，柱溫55℃，柱后冷卻溫度30℃，檢測器溫度45℃，進樣體積10 μL。

水溶性組分中葡萄糖和木糖的測定[18]:0.005 mol·L-1硫酸將水浸出液稀釋至合適倍數(shù)后，采用HPLC 測定葡萄糖和木糖含量。

水溶性組分中葡聚糖和木聚糖的測定[18]:量取7 mL 水浸出液，加入0.25 mL 72%硫酸，于121℃反應(yīng)1 h，冷卻，用0.005 mol·L-1硫酸稀釋至合適倍數(shù)，采用HPLC 測定葡萄糖和木糖含量，分別乘以系數(shù)0.9 和0.88，換算為葡聚糖和木聚糖含量。

1.3.4 粒度分布 在相同的粉碎條件下(一次投料量200 g，粉碎15 s)，取50 g 粉碎后的樣品，分別記錄通過孔徑(d)為0.850、0.425、0.250、0.180、0.125、0.075 mm 標(biāo)準(zhǔn)篩的樣品質(zhì)量，計算樣品的粒度分布。

1.3.5 油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖分離方法 研究輻照劑量(0、200、400、600、800 kGy)，反應(yīng)溫度(80、90、100℃)和反應(yīng)時間(2、3、4 h)對油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖的分離效果。稱取10.0 g(精確至0.000 1 g)樣品于250 mL 直三口燒瓶，按1∶10(g·mL-1)加入100 mL 88%甲酸溶液，80 ～100℃水浴反應(yīng)2 ～4 h，攪拌速度200 r·min-1。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，濾渣用100 mL 88%甲酸溶液沖洗，再用去離子水沖洗至中性，最后于60℃烘干，即為纖維素。濾液采用60℃減壓濃縮至近干，濃縮液加入7 倍體積的蒸餾水，析出木質(zhì)素，抽濾，濾渣采用去離子水清洗至中性，于60℃烘干，即為木質(zhì)素。收集濾液，減壓濃縮去除甲酸，即為木糖。

1.3.6 油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖提取率和純度分析 根據(jù)公式計算纖維素、木質(zhì)素和木糖提取率:

式中，m 為油茶殼干重；mc、ml和mx分別為分離獲得纖維素干重、木質(zhì)素干重和濾液中木糖質(zhì)量；pc和pl分別為分離獲得的纖維素和木質(zhì)素純度；wc，wl和wx分別為油茶殼中纖維素、木質(zhì)素和木聚糖的含量。

根據(jù)公式計算纖維素、木質(zhì)素純度[18]:

式中，msc和msl分別為兩步硫酸水解測定的纖維素和木質(zhì)素含量；mc和ml分別為分離獲得纖維素和木質(zhì)素干重。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003 和Origin 8.0 進行數(shù)據(jù)圖像處理，SPSS 17.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照處理對油茶殼粉碎能耗和粒度分布的影響

由圖1-A 可知，在0～400 kGy 劑量范圍內(nèi)，隨著輻照劑量的增加，油茶殼粉碎能耗下降，400 kGy 劑量輻照處理的油茶殼與對照相比，節(jié)約能耗43.59%，當(dāng)輻照劑量大于400 kGy，粉碎能耗下降趨勢變緩。將粉碎能耗對輻照劑量進行曲線擬合，擬合度R2達到0.899。由圖1-B 可知，隨著輻照劑量的增加，油茶殼粉碎后粗顆粒粉末所占比例逐漸減少，細(xì)顆粒含量逐漸增加，當(dāng)輻照劑量達到800 kGy 時，d ＜0.075 mm 顆粒所占比例達到41.38%。說明輻照處理后油茶殼更加容易粉碎，從而使粉碎能耗降低，粉碎后顆粒粒徑更小。

圖1 輻照處理對油茶殼粉碎能耗(A)和粒度分布(B)的影響Fig.1 Effect of irradiation on crushing energy consumption (A) and particle size distribution (B) of camellia oleifera shell

2.2 輻照處理對油茶殼組成成分的影響

由表1可知，油茶殼中纖維素、木聚糖和木質(zhì)素均隨輻照劑量的增加逐漸降低，其中木聚糖降幅最大，其次為纖維素，木質(zhì)素最難降解。隨著輻照劑量的增加，油茶殼水溶性組分逐漸增多，水洗液中的葡萄糖和木糖及葡聚糖和木聚糖含量均呈增加趨勢，當(dāng)輻照劑量為800 kGy 時，水溶性組分含量最大(38.51%)，水溶性木糖和木聚糖含量均達到最大值，分別為43.07 mg·g-1和105.52 mg·g-1。說明輻照處理后油茶殼中纖維素、木聚糖等成分發(fā)生降解，由不溶性變?yōu)樗苄?，從而使水洗液中糖含量增加?/p>

2.3 油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖分離工藝研究

2.3.1 輻照劑量對油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖分離效果的影響 由圖2-A 可知，當(dāng)輻照劑量從0 增加至200 kGy 時，油茶殼纖維素的提取率顯著升高至最大值(91.90%)，隨后隨著輻照劑量的增加逐漸降低；當(dāng)輻照劑量為0～400 kGy 時，油茶殼木質(zhì)素的提取率顯著升高，輻照劑量為400 kGy 時，其提取率為46.07%，輻照劑量繼續(xù)增加，提取率差異不顯著；油茶殼木糖的提取率隨著輻照劑量的增加呈升高趨勢，在輻照劑量為800 kGy 時達到最大值(76.31%)，其中0 ～400 kGy各處理組之間差異顯著。由圖2-B 可知，當(dāng)輻照劑量為0～400 kGy 時，甲酸分離獲得的油茶殼纖維素純度逐漸增加，輻照劑量為400 kGy 時達到最大值(40.40%)，輻照劑量繼續(xù)增加，純度稍有下降，總體變化差異均不顯著；當(dāng)輻照劑量為0 ～600 kGy 時，分離獲得的木質(zhì)素純度逐漸升高，輻照劑量為600 kGy 時達到最大值(82.24%)，且400 ～600 kGy 劑量范圍內(nèi)差異不顯著。綜合考慮分離效果和輻照成本，選擇最佳輻照劑量為400 kGy，此條件下，纖維素、木質(zhì)素和木糖的提取率分別為86.75%、46.07%和62.04%，纖維素和木質(zhì)素純度分別為40.40%和81.39%。

表1 輻照處理后油茶殼組成成分的變化Table1 Changes in composition of camellia oleifera shell after irradiation pretreatment

圖2 輻照劑量對甲酸分離油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖提取率(A)和純度(B)的影響Fig.2 Effect of irradiation dose on extraction rate(A) and purity (B) of cellulose，lignin and xylose from camellia oleifera shell by formic acid separation

2.3.2 反應(yīng)溫度對油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖分離效果的影響 由圖3-A 可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，油茶殼纖維素提取率逐漸降低，80℃時纖維素提取率最高為90.85%；油茶殼木質(zhì)素的提取率隨著反應(yīng)溫度的升高逐漸升高，100℃時達到最大值(47.90%)，80℃和90℃加熱組的油茶殼木質(zhì)素提取率存在顯著差異，當(dāng)溫度繼續(xù)提高，差異不顯著；隨著反應(yīng)溫度的升高，油茶殼木糖提取率顯著升高，100℃時達到最大值(96.37%)。由圖3-B 可知，隨反應(yīng)溫度的升高，纖維素和木質(zhì)素純度均顯著增加，100℃時均達最大值，分別為45.35%和91.92%。

圖3 反應(yīng)溫度對甲酸分離油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖提取率(A)和純度(B)的影響Fig.3 Effect of different reaction temperature on extraction rate(A) and purity (B) of cellulose，lignin and xylose from camellia oleifera shell by formic acid separation

2.3.3 反應(yīng)時間對油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖分離效果的影響 由圖4-A 可知，經(jīng)過3 h 反應(yīng)，油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖的提取率均達到最大值，分別為89.94%、47.74%和96.37%，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，纖維素的提取率顯著下降，木質(zhì)素和木糖提取率無顯著變化；由圖4-B 可知，纖維素和木質(zhì)素純度也均在反應(yīng)3 h 時達到最大值，分別為45.05%和91.92%，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，纖維素純度顯著降低，木質(zhì)素純度無顯著變化。

圖4 反應(yīng)時間對甲酸分離油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖提取率(A)和純度(B)的影響Fig.4 Effect of different reaction time on extraction rate(A) and purity (B) of cellulose，lignin and xylose from camellia oleifera shell by formic acid separation

3 討論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)輻照處理后油茶殼粉碎能耗降低，400 kGy 輻照處理后油茶殼粉碎能耗比對照節(jié)約43.59%，Liu 等[19]研究表明經(jīng)800 kGy 劑量輻照處理后木質(zhì)纖維素材料的粉碎能耗是未處理材料的1/3～1/4。粉碎過程是一個能量消耗的過程，降低粉碎能耗有助于降低整個工藝成本。本研究發(fā)現(xiàn)，油茶殼粉碎后細(xì)顆粒樣品所占比例隨輻照劑量增加而增加，800 kGy 輻照處理油茶殼，粉碎后d＜0.075 mm 和d＜0.125 mm 顆粒所占比例分別達到41.38%和78.56%，Zhang等[20]對輻照處理后油菜秸稈粒度分布和比表面積變化的研究也發(fā)現(xiàn)，隨著輻照劑量增加顆粒直徑逐漸減小，同時比表面積顯著增加，這有利于底物和溶劑的充分接觸，提高樣品的反應(yīng)性能。陳亮等[21]和Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，輻照作為一種有效的預(yù)處理方法能夠有效破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，改變生物質(zhì)的物理化學(xué)特性，有利于后續(xù)反應(yīng)的進行。輻照處理后油茶殼纖維素、半纖維素發(fā)生降解，水溶性葡聚糖和木聚糖含量均增加，有利于甲酸提取過程中提高木糖的提取率。

比較不同輻照劑量處理，400 kGy 劑量輻照處理的油茶殼，在甲酸濃度為88%的體系中分離纖維素、木質(zhì)素和木糖效果最佳。在0 ～400 kGy 劑量范圍內(nèi)，增加輻照劑量對提高甲酸分離纖維素、木質(zhì)素和木糖的效果具有促進作用，這可能是由于經(jīng)輻照處理后，生物質(zhì)表觀結(jié)構(gòu)被破壞，形成較多孔洞[23]，有利于分離過程中甲酸與底物的接觸；同時，經(jīng)輻照處理后木質(zhì)纖維素的熱穩(wěn)定性下降，反應(yīng)活化能降低[24-26]，樣品更容易發(fā)生反應(yīng)；但輻照劑量繼續(xù)增大，會導(dǎo)致纖維素降解程度加劇，影響纖維素的提取率，同時也會增加工藝成本。反應(yīng)溫度和時間對甲酸提取效果也具有一定影響，通常溫度越高，纖維素和半纖維素水解越劇烈[7]，所以100℃條件下甲酸提取會導(dǎo)致纖維素的提取率降低，但木糖和木質(zhì)素提取率增高，同時纖維素和木質(zhì)素的純度也最高。反應(yīng)時間為3 h 時，甲酸提取效果最佳，反應(yīng)時間較短，不利于甲酸與底物的充分接觸，反應(yīng)時間過長，半纖維素降解產(chǎn)生的有機酸不斷積累，導(dǎo)致纖維素發(fā)生水解影響提取率，同時長時間高溫反應(yīng)會造成木糖進一步降解[27]。

徐小樂等[28]采用甲酸-乙酸體系對苧麻麻骨中的纖維素和木質(zhì)素進行提取分離，當(dāng)甲酸∶乙酸∶水的比值為45∶35∶20，固液比為1∶20(g·mL-1)，提取溫度為100℃時，纖維素得率為66.54%，木質(zhì)素得率為35.10%。由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)緊密，直接進行分離產(chǎn)物的得率和純度均較低，通過輻照處理有利于提高分離效果。本研究采用的油茶殼經(jīng)400 kGy 輻照處理后，在88%甲酸體系中100℃反應(yīng)3 h，纖維素、木質(zhì)素、木糖的提取率分別為89.94%、47.74%和96.37%，分離獲得的纖維素和木質(zhì)素純度分別為45.05%和91.92%。但輻照處理成本相對較高，通過提高反應(yīng)溫度和加入催化劑等方法進一步降低輻照劑量，將是后續(xù)的研究方向。

4 結(jié)論

適當(dāng)?shù)妮椪仗幚砟軌蚱茐挠筒铓つ举|(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，提高甲酸分離木質(zhì)素、纖維素和木糖的純度和提取率。本研究結(jié)果表明，當(dāng)輻照劑量低于400 kGy，增加輻照劑量有利于提高甲酸分離油茶殼纖維素、木質(zhì)素和木糖的效果，說明輻照處理有利于甲酸分離生物質(zhì)中木質(zhì)纖維素組分。400 kGy 輻照劑量處理的油茶殼，在88%甲酸體系中，100℃反應(yīng)3 h，纖維素和木糖的提取率分別為89.94%和96.37%，木質(zhì)素純度為91.92%，說明輻照協(xié)同甲酸分離木質(zhì)纖維素效果好。若要進一步利用分離獲得的組分，需對其組成和結(jié)構(gòu)進行深入分析，這是本研究的不足之處，也是后期有待研究的方向。