丁慧璞 歐陽偉虹 黃玉婷 張 捷 王志江 劉利萍

(1浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100；2浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校制藥工程學(xué)院，浙江 寧波 315100)

小黃魚在加工過程中會(huì)產(chǎn)生50%左右的邊角料，魚類邊角料含有豐富的蛋白質(zhì)和微量元素。然而，魚類邊角料腥味重，多數(shù)企業(yè)對其深加工技術(shù)不到位，導(dǎo)致企業(yè)對于邊角料的儲(chǔ)存與利用較為困難，大部分作為魚飼料低價(jià)出售，有些邊角料甚至廢棄造成環(huán)境污染[1]。目前對魚類邊角料開發(fā)利用多采用酶解技術(shù)，如姜紹通等[2]用中性蛋白酶對白鰱魚骨進(jìn)行酶解開發(fā)魚湯，經(jīng)酶解后魚腥味明顯減弱，熬煮的魚湯中游離氨基酸含量增加，魚湯呈鮮香味，且其酶解產(chǎn)物具有抗氧化性和抑菌性；施永清等[3]利用堿性蛋白酶和酸性蛋白酶對鯽魚魚鱗進(jìn)行酶解制備了抗菌肽，其對副溶血弧菌的抑菌圈直徑高達(dá)27.72 mm；涂丹等[4]采用堿性蛋白酶酶解羅非魚魚鱗制備了魚鱗蛋白降血壓活性肽；董亞飛等[5]采用復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對帶魚下腳料進(jìn)行酶解制備鋅螯合物；Ji 等[6]用木瓜蛋白酶酶解小黃魚蛋白，得到的酶解產(chǎn)物對·OH、DPPH 自由基的清除效率隨著水解度的增大而增大，證明了利用酶法水解小黃魚蛋白質(zhì)可制備具有抗氧化性的水解產(chǎn)物。

生物酶解技術(shù)運(yùn)用于食品制作可顯著改善食品的風(fēng)味[7]。通過生物酶解小黃魚邊角料可產(chǎn)生大量的L-氨基酸和多肽，在酶解溫度下與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)改善產(chǎn)品風(fēng)味[8]。酶制劑類型、酶解程度對酶解產(chǎn)品的品質(zhì)，如氨基酸態(tài)氮含量、鮮味等均有較大影響，甚至可能產(chǎn)生苦味肽，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的風(fēng)味[9-10]。因此，研發(fā)適宜的酶解條件是小黃魚邊角料開發(fā)濃縮魚湯的基礎(chǔ)。

本研究在前期小黃魚邊角料脫腥工藝試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，優(yōu)化小黃魚邊角料的酶解工藝條件，獲得富含氨基酸、多肽的小黃魚邊角料酶解液；并對小黃魚邊角料酶解液進(jìn)行分離純化，得到不同分子量的多肽，對酶解多肽的抗氧化性和抗菌活性進(jìn)行評價(jià)，旨在為利用小黃魚邊角料制備具有功能活性的濃縮魚湯及其產(chǎn)業(yè)化提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

小黃魚邊角料，寧波蘭洋水產(chǎn)食品有限公司；KA66 酵母抽提物(批號(hào)2017012202E9)，安琪酵母股份有限公司；堿性蛋白酶(酶活力為2×105U·g-1)、木瓜蛋白酶(酶活力為8×105U·g-1)、酸性蛋白酶(酶活力為5×104U·g-1)，寧波豐肽生物科技有限公司；福林酚(1 mol·L-1)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-谷胱甘肽(L-glutathione，純度>99.0%，氧化型，GSH)，北京索萊寶科技有限公司； N，N，-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、三羥甲基甘氨酸(trimethylolglycine，Tricine)、三羥甲基氨基甲烷(trihydroxymethyl aminomethane，Tris 堿)、考馬斯亮藍(lán)G-250、甲醛、氫氧化鈉、酚酞、乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀、三氯乙酸、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、鐵氰化鉀、氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Lowery 蛋白定量試劑盒，南京萊富賽生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(1，1-diphenyl-2-bitter hydrazine radical，DPPH)，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展公司；牛血清蛋白，上海申航生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酵母菌(Saccharomyce)、大腸桿菌(Escherichia coli.) 和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，浙江萬里學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PowerPacTMBasic 型電泳儀，美國Bio-rad 公司；T6型紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；6-16K型低速大容量冷凍離心機(jī)，德國Sigma 公司；透析袋(壓平寬度34 mm，直徑22 mm，分子截留300 Da)，美國Viskase 公司；R-200 型中低壓層析系統(tǒng)，廣東瑞柏儀器科技有限公司；2.6 cm×30 cm DEAE-52 層析柱，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；SHA-B 型恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；R201O 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 小黃魚邊角料的酶解試驗(yàn)

1.3.1 酶解液的制備工藝 冰凍小黃魚邊角料→解凍、漂洗、瀝干→按固液比1∶2 加水制魚糜→添加酵母抽提物脫腥→添加蛋白酶進(jìn)行酶解→煮沸滅酶→離心(4 000 r·min-1，5 min)→小黃魚酶解液[11]。

1.3.2 酶制劑的篩選 選取木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶3 種酶對脫腥后小黃魚魚糜進(jìn)行酶解，酶解時(shí)按底物蛋白固定加酶量為120 U·g-1，其中堿性蛋白酶在55℃、pH 值9 條件下酶解[12]；木瓜蛋白酶在50℃、pH 值7.0 條件下酶解[13]；酸性蛋白酶在55℃、pH 值3.0 條件下酶解[3]，酶解時(shí)間均為0.5 h。以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)[11]，比較3 種酶的酶解效果。

1.3.3 酶解工藝的單因素試驗(yàn) 以氨基酸肽氮含量為指標(biāo)，稱取100 g 魚糜12 份，固定酶解溫度55℃，分別進(jìn)行以下酶解試驗(yàn):按底物蛋白加酶量107 U·g-1，酶解液pH 值9，考察不同酶解時(shí)間(0.5、1、2、4 h)對酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的影響；按底物蛋白加酶量107 U·g-1，酶解時(shí)間0.5 h，考察酶解液不同pH 值(8、9、10、11)對酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的影響；酶解時(shí)間0.5 h，酶解液pH 值9，考察不同底物蛋白加酶量(107、215、322、430 U·g-1)對酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的影響。上述酶解反應(yīng)完畢，滅酶活，離心，取5 mL 上清液稀釋至50 mL，測定稀釋液中氨基酸態(tài)氮含量。

1.3.4 酶解工藝優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇底物蛋白加酶量為107、215、322 U·g-1，酶解時(shí)間為0.5、1、2 h，酶 解pH 值為9、10、11，利用Design-Expert 8.0.6 軟件，采用Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以氨基酸態(tài)氮為指標(biāo)，優(yōu)化小黃魚邊角料酶解條件。試驗(yàn)因素水平見表1。

1.4 小黃魚邊角料酶解液的分離純化

1.4.1 酶解液中多肽含量的測定 采用雙縮脲法[14]測定最優(yōu)條件制備的酶解液中的多肽含量。以0、2、4、6、8、10 mg·mL-1牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定A540nm，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.047x＋0.005 9，R2＝0.996 8。

1.4.2 DEAE-52 柱分離純化酶解液 參照文獻(xiàn)[15]的方法并略作調(diào)整，將最適酶解條件下制備的酶解液離心，過0.45 μm 膜，上樣2 mL，流速1.5 mL·min-1，于190 nm 波長處檢測吸光度值。收集分離組分全峰，重復(fù)多次，合并相同組分。將分離組分用透析袋透析至中性后旋蒸濃縮至5 mL，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳測定多肽分子量 參照文獻(xiàn)[16]的方法并略作調(diào)整。夾層膠、濃縮膠和分離膠的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、10%、16.5%。將響應(yīng)面優(yōu)化所得酶解液多肽配制成10 mg·mL-1的溶液，于95℃保溫5 min，10 000 r·min-1離心2 min 后，再與標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 溶液分別上樣5 μL 進(jìn)行電泳(電泳條件:恒壓30 V 通過濃縮膠和夾層膠、恒壓100 V 通過分離膠)。

1.4.4 福林酚法測定各組分中多肽含量 參照文獻(xiàn)[17]的方法并略作調(diào)整。取6 支試管分別加入0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg·mL-1牛血清蛋白溶液各1 mL，根據(jù)試劑盒測試說明書進(jìn)行后續(xù)操作，反應(yīng)完成后于500 nm 波長處測定吸光度值，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肽含量:y＝2.29x-0.004 1，R2＝0.991 8。

1.5 小黃魚邊角料酶解液的抗氧化性測定

1.5.1 酶解液對自由基清除率的測定 樣品預(yù)處理:于5 mL 酶解液中加入5 mL 10%三氯乙酸，漩渦混勻后靜置10 min，4 000 r·min-1離心5 min，收集上清液稀釋2、3、4、5 倍備用。

·OH 清除率測定:參照文獻(xiàn)[18]的方法測定。

DPPH 自由基清除率測定:參照文獻(xiàn)[19]的方法并略作調(diào)整。取1.5 mL 待測酶解液至1.5 mL 含0.10 mmol·L-1DPPH 自由基的95%乙醇中，混勻，避光靜置30 min，于517 nm 波長處測定吸光度值，記為Ax；以1.5 mL 水和1.5 mL DPPH 自由基溶液作空白組，測定吸光度值，記為A0；以1.5 mL 待測酶解液和1.5 mL 95%乙醇作樣品對照，測定吸光度值，記為Ax0。同時(shí)，以谷胱甘肽(glutathione，GSH)為陽性對照。按照公式計(jì)算自由基清除率:

1.5.2 酶解液還原力的測定 參照文獻(xiàn)[20]的方法測定。

1.6 小黃魚邊角料酶解多肽的抑菌性測定

1.6.1 多肽對4 種微生物的抑菌性比較 參照文獻(xiàn)[21]的方法。取濃度為1×106CFU·mL-1枯草芽孢桿菌、酵母菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液各50 μL于5 支試管中，分別加入100 μL 的無菌蒸餾水、多肽組分Ⅰ～Ⅳ(濃度為100 μg·mL-1)，再加入液體培養(yǎng)基至5 mL，37℃搖床培養(yǎng)24 h 后測定菌懸液的A600nm。

1.6.2 多肽組分Ⅲ對4 種微生物生長的抑制 每種菌液(1×106CFU·mL-1)各取50 μL 于不同試管中，分別加入100 μL 蒸餾水、多肽組分Ⅲ(濃度為100 μg·mL-1)，再加入液體培養(yǎng)基至5 mL，考察不同菌在0、3、6、12、18、24 h 的生長情況，并以A600nm為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)菌生長曲線。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，平行3 次。用Design Expert 8.0.6 軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用SPSS 17.0 軟件的Duncan 法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑的篩選

由圖1可知，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶在最適酶解條件下酶解液的氨基酸態(tài)氮含量分別為0.273 4、0.267 6 g·100 g-1，極顯著高于酸性蛋白酶(0.208 1 g·100 g-1)和未酶解組(0.212 g·100 g-1)。比較堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解液的風(fēng)味和口感，選擇堿性蛋白酶為酶制劑。

圖1 不同酶制劑酶解小黃魚邊角料酶解液中氨基酸態(tài)氮的含量Fig.1 Amino acid nitrogen content in enzymatic hydrolysis of small yellow croaker scraps with different protease

2.2 酶解工藝的影響因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間的影響 由圖2可知，小黃魚邊角料酶解液中氨基酸態(tài)氮含量隨酶解時(shí)間延長而增加，酶解2 h 后，其水解度變化趨緩。這可能是由于酶解初始，底物與酶的質(zhì)量濃度均較高，接觸面較大，酶解速度較快，水解度增幅較大；隨著反應(yīng)進(jìn)行，酶量減少，酶解液中游離肽不斷積累，水解度趨緩。因此后續(xù)進(jìn)一步對酶解時(shí)間0.5～2 h 進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 酶解時(shí)間對小黃魚邊角料酶解液氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 The effect of enzymolysis time on amino acid nitrogen content in enzymatic hydrolysate of small yellow croaker scarps

2.2.2 酶解液pH 值的影響 由圖3可知，氨基酸態(tài)氮含量隨酶解液pH 值增加而增大，當(dāng)pH 值為8 時(shí)最低，當(dāng)pH 值介于9～10 時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量增幅較大，而pH 值為10～11 時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量變化趨于平緩。后續(xù)進(jìn)一步對酶解液pH 值9～11 進(jìn)行優(yōu)化。

圖3 pH 對小黃魚邊角料酶解液氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 The effect of pH on amino acid nitrogen content in enzymatic hydrolysate of small yellow croaker scarps

2.2.3 加酶量的影響 由圖4可知，小黃魚邊角料酶解液中氨基酸態(tài)氮含量隨著加酶量增加呈先增加后緩慢減小的趨勢。當(dāng)加酶量達(dá)到215 U·g-1時(shí)酶解液中氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到0.298 1 g·100g-1；隨著加酶量繼續(xù)增加，氨基酸態(tài)氮含量反而略有下降，可能是酶解產(chǎn)物與酶形成復(fù)合物，阻礙了底物與酶的結(jié)合，減緩了蛋白水解。因此后續(xù)進(jìn)一步對加酶量107 ～322 U·g-1進(jìn)行優(yōu)化。

圖4 加酶量對小黃魚邊角料酶解液氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 The effect of enzyme dosage on amino acid nitrogen content in enzymatic hydrolysate of yellow croaker scraps

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝的結(jié)果及驗(yàn)證

2.3.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 對表2進(jìn)行回歸分析得到相應(yīng)的二次響應(yīng)面回歸方程:

Y＝0.40＋0.077A＋0.014B＋0.031C-1.0×10-4AB-1.70×10-3AC＋4.13×10-3BC-0.012A2-8.01×10-3B2-0.023C2。

由表3可知，回歸模型P＜0.000 1，模型極顯著；一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)C2對小黃魚邊角料酶解液中氨基酸態(tài)氮含量影響極顯著(P＜0.01)，二次項(xiàng)A2對小黃魚邊角料酶解液中氨基酸態(tài)氮含量影響顯著(P＜0.05)，說明加酶量、酶解液pH 值與酶解時(shí)間對酶解效果影響顯著。失擬項(xiàng)P＝0.051 7，表明模型擬合程度良好；根據(jù)F值得出各因素對小黃魚邊角料酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的影響表現(xiàn)為A>C>B。相關(guān)系數(shù)R2＝0.992 7，說明響應(yīng)值的變化有99.27%與所選變量有關(guān)。模型的校正系數(shù)＝98.32%，說明不確定因素對試驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，該模型與數(shù)據(jù)擬合度較高，比較可靠[22]，可用于分析和預(yù)測小黃魚邊角料酶解液中氨基酸態(tài)氮含量。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Analysis of variance of regression model

表2 酶解條件的Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table2 Box-Behnken response surface experiment results of enzymatic conditions

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 響應(yīng)曲面中等高線的曲率大小可以直接反映出因素之間的交互作用，曲率越大并呈橢圓形表示兩因素的交互作用明顯，曲率越小并呈圓形表示兩因素的交互作用不明顯。由圖5可知，交互項(xiàng)AB、BC、AC對結(jié)果影響不明顯，出現(xiàn)這種情況可能與試驗(yàn)中各因素水平范圍不夠精細(xì)有關(guān)。但從響應(yīng)面圖可以看出，加酶量的增加和酶解時(shí)間的延長，有利于酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的增加。但酶解越徹底得到的酶解液色澤越深，且會(huì)產(chǎn)生具有苦味的多肽，影響產(chǎn)品的外觀和風(fēng)味。

通過模型預(yù)測小黃魚邊角料酶解的最優(yōu)條件為:采用堿性蛋白酶，在固液比1∶2，酶解溫度55℃，加酶量322 U·g-1、酶解液pH 值11、酶解時(shí)間2 h 條件下，預(yù)測酶解液中氨基酸態(tài)氮含量為0.490 6 g·100 g-1。在此條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果為0.545 2 g·100 g-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.10%，表明該酶解工藝條件穩(wěn)定可行。

2.4 酶解液中多肽的分離純化結(jié)果

2.4.1 酶解多肽分離純化與分子量測定 由圖6可知，小黃魚邊角料酶解液經(jīng)DEAE-52 層析柱分離得到4 組多肽，組間完全分離。隨分離時(shí)間的延長，收集的組間多肽量依次減少，說明小黃魚邊角料經(jīng)堿性蛋白酶酶解得到的是不同分子量的多肽混合物，這與堿性蛋白酶專一性差、有多個(gè)酶切位點(diǎn)有關(guān)[23]。分離得到的組分Ⅰ～組分Ⅳ多肽的凝膠電泳圖如圖7所示。測定得到組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中多肽的分子量分別為14.4～20.1 kDa、5.8～7.8 kDa、＜3.3 kDa，組分Ⅳ未出現(xiàn)蛋白條帶，這可能是其分子量太小所致。

圖5 各酶解因素的交互作用對酶解液氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of interaction of various enzymatic factors on amino acid nitrogen content in enzymatic hydrolysate

2.4.2 酶解多肽含量測定結(jié)果 小黃魚邊角料酶解液中蛋白多肽含量較高，采用雙縮脲試劑法測定；對于分離得到的組分多肽含量采用Folin-酚法測定，酶解液及各組分多肽含量見表4。

2.5 體外抗氧化測定結(jié)果

2.5.1 自由基清除率 圖8是小黃魚酶解多肽與陽性對照組GSH 對·OH 的清除率，均呈現(xiàn)濃度依懶性，經(jīng)擬合分別得方程為:酶解液y＝3.47x＋45.67，R2＝0.982 4；谷胱甘肽y＝7.95x＋6.57，R2＝0.992 3。酶解液和GSH 對·OH 清除能力的IC50值分別為1.25、5.46 mg·mL-1，說明小黃魚邊角料酶解液在一定濃度范圍內(nèi)對·OH 的清除能力強(qiáng)于GSH，當(dāng)小黃魚酶解多肽濃度為8.62 mg·mL-1時(shí)，對·OH 的清除率約為80%，這與酶解液中多肽的-NH2或-COOH 與Fe2＋絡(luò)合阻斷了·OH的生成有關(guān)[24]。

圖6 小黃魚邊角料酶解多肽的DEAE－52 層析柱梯度洗脫曲線Fig.6 DEAE－52 column gradient elution curve of enzymatic hydrolysate of small yellow croaker scraps

表4 小黃魚邊角料酶解液與組分Ⅰ～組分Ⅳ中多肽的含量Table4 Polypeptide content in enzymatic hydrolysate and Ⅰ～Ⅳfractions of small yellow croaker scraps/(μg·mL－1)

圖7 各組多肽的SDS-PAGE 電泳圖Fig.7 SDS-PAGE electrophoresis of polypeptide of all fractions

圖9是小黃魚酶解液與陽性對照GSH 對DPPH自由基的清除率，也呈現(xiàn)濃度依懶性。經(jīng)擬合分別得方程為:酶解液y＝2.06x＋14.85，R2＝0.819 2；谷胱甘肽y＝689.80x＋18.37，R2＝0.992 0，對應(yīng)的IC50值分別為17.07 和0.05 mg·mL-1，表明小黃魚邊角料酶解液對DPPH 自由基的清除率弱于GSH。但是隨著小黃魚邊角料酶解液多肽濃度的提高，其對DPPH 自由基的清除率也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)小黃魚酶解液多肽濃度為25.59 mg·mL-1時(shí)，對DPPH 自由基的清除率為61.26%。這與酶解多肽能提供類似氫供體的氨基酸有關(guān)，這些氨基酸親近DPPH 自由基形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，達(dá)到清除DPPH 自由基的效果[25]。

圖8 小黃魚邊角料酶解多肽對·OH 的清除率Fig.8 Scavenging rate of·OH by enzymatic hydrolysis polypeptide of small yellow croaker scraps

2.5.2 還原力測定結(jié)果 還原力說明酶解多肽具有供給電子的能力[26]，能作為初級(jí)和次級(jí)抗氧化劑減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，具有抗氧化作用。由圖10可知，隨著小黃魚邊角料酶解液多肽濃度的增加，其還原力增強(qiáng)。當(dāng)小黃魚邊角料酶解液多肽濃度為9 mg·mL-1時(shí)，其還原力與GSH 濃度為0.06 mg·mL-1的還原力一致。表明小黃魚邊角料酶解液多肽的還原力遠(yuǎn)弱于GSH。

圖9 小黃魚邊角料酶解多肽對DPPH 自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of DPPH by enzymatic hydrolysis polypeptide of small yellow croaker scraps

圖10 小黃魚邊角料酶解多肽的還原力Fig.10 Reductive power of enzymatic hydrolysis polypeptide from small yellow croaker scraps

2.6 酶解液多肽的抑菌性試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 不同組分多肽對4 種細(xì)菌的抑制率比較 一般來說，細(xì)菌濃度與吸光度值A(chǔ) 呈正相關(guān)性。由圖11可知，組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ對4 種細(xì)菌基本無抑制效果反而促進(jìn)了細(xì)菌增長(除組分Ⅱ?qū)Υ竽c桿菌有微弱抑菌效果)，多肽組分Ⅲ對4 種細(xì)菌的抑菌效果均極顯著高于空白組(P＜0.01)。這可能是由于組分Ⅰ、Ⅱ分子量較大，是未完全水解蛋白，組分Ⅳ主要是分子量較小的氨基酸，是水解度過高的組分，可為細(xì)菌提供營養(yǎng)物質(zhì)氮，促進(jìn)細(xì)菌的生長[25]。組分Ⅲ多肽的分子量低于3.3 kDa，有文獻(xiàn)報(bào)道分子量在1～3 kDa 的多肽抑菌性強(qiáng)、普適性廣，具有良好的抑菌效果[27]。

2.6.2 組分Ⅲ多肽對細(xì)菌生長曲線的影響 由圖12可知，經(jīng)組分Ⅲ多肽處理過的4 種菌液中各菌的生長速度均比空白組緩慢，表明組分Ⅲ中的多肽具有抑菌作用。有文獻(xiàn)認(rèn)為分子量為3.3 kDa 左右的多肽類物質(zhì)具有裂膜抑菌機(jī)制，使得細(xì)菌生長受到抑制或死亡[27]。

圖11 4 組多肽對不同細(xì)菌的抑制效果Fig.11 Inhibitory effects of four polypeptide components on different bacteria

3 討論

小黃魚邊角料經(jīng)酶解后產(chǎn)生的氨基酸和多肽可賦予產(chǎn)品更好的營養(yǎng)價(jià)值，更有利于人體消化吸收利用，豐富的氨基酸可提高產(chǎn)品的鮮味[28]，L-氨基酸和多肽在酶解溫度下與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)還能改善產(chǎn)品風(fēng)味[29]。

本研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解液的氨基酸態(tài)氮含量顯著高于酸性蛋白酶和未酶解組。木瓜蛋白酶屬巰基蛋白酶，可水解蛋白質(zhì)中精氨酸和賴氨酸的羧基端，并優(yōu)先水解肽鍵或蛋白N 端具有2 個(gè)羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽鍵[30]。堿性蛋白酶為非特異性內(nèi)切酶，作用位點(diǎn)多、酶解效率高、還兼具脫腥和改善產(chǎn)品風(fēng)味的效果，作用于色氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸參與形成的多種肽鍵，堿性蛋白酶酶切位點(diǎn)較多，能較徹底水解底物蛋白，得到的酶解液中多肽分子量較小，且其制備的魚湯營養(yǎng)成分更容易被吸收。趙琪等[31]比較了5 種蛋白酶對河蜆蛋白的水解效果，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解效果良好；Su等[32]用堿性蛋白酶對黃花魚內(nèi)臟進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶在酶解水產(chǎn)蛋白方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢。比較本試驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌负蛪A性蛋白酶對小黃魚邊角料的酶解效果、產(chǎn)品風(fēng)味以及蛋白酶的性價(jià)比，選擇堿性蛋白酶作為小黃魚的酶制劑。

圖12 多肽組分Ⅲ對枯草芽孢桿菌、酵母菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌生長曲線的影響Fig.12 Effect of polypeptide fraction Ⅲon growth curve of Bacillus subtilis，Saccharomyce，Staphylococcus aureus，Escherichia coli

本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶解液的固液比(m∶v)為1∶2、按底物蛋白加酶量322 U·g-1、酶解液pH 值11、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間2 h 時(shí)，得到的酶解液中氨基酸態(tài)氮含量為0.545 2 g·100 g-1。加酶量、酶解時(shí)間和酶解液pH 值對小黃魚邊角料的酶解效果均有較大影響，在本試驗(yàn)選擇的水平范圍內(nèi)，這些酶解因素之間的交互作用不顯著。張群飛等[12]用堿性蛋白酶酶解蝦籽也發(fā)現(xiàn)酶解溫度(45 ～55℃)與時(shí)間(3 ～5 h)、酶解溫度與pH 值(7 ～8)之間的交互作用不明顯；而Cai等[33]用4 種酶對牛骨蛋白進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)酶解溫度(胃蛋白酶30 ～40℃，堿性蛋白酶40 ～60℃，胰蛋白酶40～60 ℃，中性蛋白酶35 ～55℃)和pH 值(胃蛋白酶1.5～3.5，堿性蛋白酶7.7 ～11.7，胰蛋白6.3 ～10.3，中性蛋白酶5.3～9.3)之間具有顯著的交互作用。說明酶解因素之間是否有交互作用可能與各因子的水平選擇范圍有關(guān)。從制備濃縮魚湯角度綜合評價(jià)，本研究得到的酶解工藝參數(shù)具有水解度高、有效避免苦味肽的產(chǎn)生以及酶解液色澤較淺的優(yōu)勢。

多肽的抗氧化活性與肽段的氨基酸組成序列、相對分子質(zhì)量和空間構(gòu)造有關(guān)，這些因素又受蛋白及酶種類的影響[34]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小黃魚邊角料酶解多肽對·OH 和DPPH 自由基均具有清除作用，且清除率隨著酶解液中多肽濃度的增加而增強(qiáng)。酶解液中多肽片段增加，多肽中含有的-COOH、-OH 和-NH2等基團(tuán)可與Fe2＋絡(luò)合阻斷·OH 的生成，也可作為質(zhì)子給予體與DPPH 自由基結(jié)合成穩(wěn)定的物質(zhì)達(dá)到清除DPPH自由基的作用。

本試驗(yàn)分離得到的4 組多肽，分子量較大(14.4 ～20.1 kDa、5.8 ～7.8 kDa)和分子量較小的多肽對微生物沒有抑菌作用，反而有促進(jìn)微生物生長的作用；但分子量小于3.3 kDa 的多肽組分Ⅲ對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和酵母菌均有抑制作用。陳彤等[35]采用中性蛋白酶對高溫變性花生餅粕進(jìn)行酶解，所得1 ～5 kDa 多肽對大腸桿菌有良好的抑菌效果。說明只有特定分子量的多肽有抑菌性，這是由于特定分子量的肽分子可以插入細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)中，使細(xì)胞內(nèi)外聯(lián)通，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致微生物生長受到抑制或死亡。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用酶解工藝處理小黃魚邊角料，結(jié)果表明，酶解的最優(yōu)條件為:采用堿性蛋白酶，固液比(m∶v)1∶2、酶解溫度55℃、按底物蛋白酶添加量322 U·g-1、酶解液pH 值11、酶解時(shí)間2 h，在此條件下得到的酶解液中氨基酸態(tài)氮含量為0.545 2 g·100 g-1。該酶解液對·OH 和DPPH 自由基表現(xiàn)出良好的抗氧化性，且隨著酶解液濃度的增加其抗氧化性增強(qiáng)。酶解液經(jīng)分離純化得到的4 組多肽，組分Ⅲ多肽對枯草芽孢桿菌、酵母菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌性能。本研究結(jié)果為小黃魚邊角料酶解液開發(fā)濃縮魚湯，實(shí)現(xiàn)低值原料的高值化利用提供了數(shù)據(jù)支持。