李 潔，黃彩云，王 艷

（1.西北師范大學體育學院，甘肅蘭州730070；2.甘肅中醫(yī)藥大學體育健康學院，甘肅蘭州730099）

隨著現(xiàn)代競技體育的發(fā)展，競技運動能力的競爭日趨激烈。在訓練中運動員被要求不斷承受超負荷刺激，以使機體產(chǎn)生新的適應，從而達到提高運動能力的目的。但機體對過強刺激不能產(chǎn)生良好的適應，甚至可能導致?lián)p傷；過弱的刺激則會大大延長適應的發(fā)生過程或無法產(chǎn)生運動訓練效果，只有在生理范圍內(nèi)適宜的刺激才能加快適應過程。因此，適宜的運動負荷是關(guān)系到運動訓練安全和有效的重要因素之一。線粒體是真核細胞內(nèi)三羧酸循環(huán)、呼吸及合成高能磷酸化合物最旺盛的部位和主要場所。自20 世紀60 年代以來，人們一直密切關(guān)注運動與線粒體的關(guān)系，有關(guān)運動與線粒體呼吸鏈功能方面的研究已有報道，如：大鼠遞增負荷力竭性運動導致肝組織線粒體呼吸鏈復合體酶（C）Ⅰ損害，呼吸鏈底物堆積［1］；大鼠耗竭游泳后，心肌和股四頭肌線粒體脂質(zhì)過氧化水平升高，心磷脂含量下降，細胞色素C 氧化酶活性降低［2］。本課題組前期的研究［3-4］也發(fā)現(xiàn)，大強度間歇疲勞運動及中等強度持續(xù)疲勞運動對大鼠肝臟及骨骼肌線粒體呼吸鏈酶活性均有不同程度的影響。經(jīng)8周大強度運動訓練，力竭運動后大鼠肝臟線粒體CⅠ、CⅡ和CⅣ活性均顯著提高［5］，骨骼肌線粒體CⅠ～Ⅲ活性均顯著升高，CⅣ活性顯著下降［6］。以上研究說明，力竭運動及不同強度疲勞運動對機體組織線粒體呼吸鏈功能產(chǎn)生影響，耐力訓練對線粒體呼吸鏈功能亦可產(chǎn)生影響，且存在組織差異性。從以往研究可以看出，運動模式多樣、運動強度或負荷不一導致研究結(jié)果系統(tǒng)性、可比性較差。因此，本文采用低負荷、中等負荷、高負荷及極高負荷運動訓練，進行不同負荷運動訓練對大鼠肝臟和骨骼肌線粒體呼吸鏈功能影響的比較研究，力求為運動訓練提供科學方案。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組

選取雄性健康2 月齡Wistar 大鼠60 只，體質(zhì)量180 g 左右（購于甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗室，動物生產(chǎn)許可證：甘SCXK 2011-001）。經(jīng)適應性喂養(yǎng)和跑臺適應性運動訓練后，保留50 只大鼠進行正式實驗。將大鼠隨機分為5 組（n=10）：對照（C）組、低負荷運動訓練（LT）組、中等負荷運動訓練（MT）組、高負荷運動訓練（HT）組和極高負荷運動訓練（ST）組。

1.2 主要藥品和儀器

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、細胞色素C（Cyt C）、輔酶Q0、抗酶素A、魚藤酮、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G250均為Sigma 公司產(chǎn)品，2，6-dichloroindophenol（DCPIP）、sodium salt hydrate、dodecyl-β-D-maltoside（β-裂解劑）均為Fluka 公司產(chǎn)品，其余藥品為國產(chǎn)分析純。DSPT-202 動物跑臺為中國杭州錢江科工貿(mào)公司制造，Universal 320R 低溫高速離心機為德國制造，UVmini-1240島津紫外可見光分光光度計為日本島津精密科學儀器有限公司制造。

1.3 訓練方案

參照文獻［7-9］方法，各運動訓練組大鼠進行遞增負荷運動訓練。LT 組跑臺坡度為5%，速度由8 m/min 遞增至 15 m/min，MT、HT 和 ST 組跑臺坡度分別為5%、10%和20%，速度均由18 m/min 遞增至27 m/min，各組運動時間均由20 min 遞增至60 min。每天（18：00—20：00）訓練1次，每周訓練6 d，共訓練8周。C 組常規(guī)飼養(yǎng)不進行運動訓練。具體訓練方案如表1所示。訓練前、后稱體質(zhì)量。

表1 訓練方案Table 1 Training program

1.4 取材及線粒體提取

按每100 g體質(zhì)量1 mL的劑量，腹腔注射0.3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，之后于冰盤上迅速取出肝臟及左、右肢股四頭肌，分別置于冷生理鹽水中清洗積血，濾紙吸干用錫紙包好，置于液氮中冷凍，-20℃低溫保存待用。按文獻［10］方法進行肝臟組織勻漿和提取線粒體，按文獻［11］方法進行肌肉組織勻漿及提取線粒體。

1.5 指標測定

（1）線粒體蛋白質(zhì)含量：以牛血清白蛋白為標準，采用考馬斯亮藍法進行測定。

（2）NADH、DCPIP、Cyt C 消光系數(shù)：分別制作NADH、DCPIP 和Cyt C 的濃度梯度，在一定波長的光波下，用光徑10 mm 的比色杯比色，記錄消光值，做出標準曲線，標準曲線的K值為各物質(zhì)的消光系數(shù)。

（3）線粒體CⅠ～Ⅳ活性：參照文獻［12］的方法，將10～20 μg 線粒體蛋白加入終體積為2 mL 的緩沖液中，以蒸餾水作空白管，校正光密度到0 點，分別測定340、600、550 nm 處3 min 吸光度（A）值的變化。復合體酶活性（μmol·mg-1·min-1）=［（△A/min×反應體積）/吸光系數(shù)］/線粒體蛋白含量，其中△A指1 min 內(nèi)A值變化。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量比較

訓練前，各組大鼠體質(zhì)量之間無顯著性差異，8周后，與C組相比，LT組大鼠體質(zhì)量下降5.53%、MT組下降2.63%、HT 組下降11.95%，但與訓練前相比均無顯著性差異，ST組顯著下降38%（P＜0.05）。不同負荷訓練組間，ST組與LT組、MT組、HT組相比均顯著下降（P＜0.05），分別下降23.53%、25.63%和18.88%，LT 組、MT組和HT組間無顯著性差異。大鼠體質(zhì)量由低到高順序為：ST組＜HT組＜LT組＜MT組＜C組（表2）。

表2 大鼠體質(zhì)量變化Table 2 Body weight change in rats

2.2 NADH、DCPIP、Cyt C消光系數(shù)

通過在反應體系中建立NDAH、DCPIP 和Cyt C濃度梯度，分別在 340、600 和 550 nm 處讀數(shù)，做出標準曲線，得NADH 消光系數(shù)為7.371，DCPIP 消光系數(shù)為17.17，Cyt C消光系數(shù)為9.01，用于酶活性的計算。

2.3 線粒體蛋白質(zhì)含量

以牛血清白蛋白為標準，采用考馬斯亮藍法測定各組大鼠肝臟和骨骼肌組織中提取的線粒體蛋白質(zhì)含量，用于酶活性的計算。其中，C、LT、MT、HT、ST組肝臟線粒體蛋白質(zhì)含量分別為1.855、1.920、1.810、2.040、1.883 mg/mL，骨骼肌組織線粒體蛋白質(zhì)含量分別為0.883、1.259、1.505、0.914、0.584 mg/mL。

2.4 肝臟線粒體CⅠ～Ⅳ活性比較

肝臟線粒體 CⅠ活性，與 C 組相比，LT 組和HT 組顯著升高（P＜0.01），分別升高88.45%和72.78%，ST組顯著下降31.08%（P＜0.05），MT 組下降10.23%，但無顯著性差異。與LT 組相比，MT 組和ST 組顯著下降（P＜0.01），分別下降52.36%和63.42%，HT 組下降8.32%，但無顯著性差異。與MT組相比，HT組顯著升高92.46%（P＜0.01），ST 組顯著下降23.22%（P＜0.05）。與HT組相比，ST組顯著下降60.11%（P＜0.01）。

肝臟線粒體CⅡ活性，與C 組相比，LT 組和ST 組顯著下降（P＜0.01），分別下降27.52%和35.93%，MT組和HT組分別上升0.82%和5.95%，但均無顯著性差異。與LT 組相比，MT 組和HT 組顯著升高（P＜0.05），分別升高39.09%和29.75%，ST 組下降11.61%，但無顯著性差異。與MT 組相比，ST 組顯著下降36.46%（P＜0.01），HT 組下降6.72%，但無顯著性差異。與HT組相比，ST組顯著下降31.88%（P＜0.01）。

肝臟線粒體CⅢ活性，與C 組相比，MT 組顯著升高21.77%（P＜0.05），HT組顯著下降32.32%（P＜0.05），ST 組升高9.03%，LT 組下降3.54%，但均無顯著性差異。與LT 組相比，MT 組顯著升高26.24%（P＜0.05），ST 組升高13.03%，HT 組下降18.53%，但均無顯著性差異。與MT 組相比，HT 組顯著降低35.47%（P＜0.01），ST 組降低10.47%，但無顯著性差異。與HT 組相比，ST組顯著升高38.74%（P＜0.01）。

肝臟線粒體CⅣ活性，與C組相比，MT組和HT組顯著下降（P＜0.05），分別下降21.44%和23.89%，LT組和ST 組分別升高14.55%和0.77%，但均無顯著性差異。與LT 組相比，MT 組和HT 組顯著下降（P＜0.01），分別下降31.42%和33.56%，ST組下降12.03%，但無顯著性差異。與MT 組相比，ST 組顯著升高28.26%（P＜0.05），HT組下降3.12%，但均無顯著性差異。與HT組相比，ST組顯著升高32.39%（P＜0.01）。

肝臟線粒體CⅠ～Ⅳ活性從高到低順序，CⅠ為：LT 組＞HT 組＞C 組＞MT 組＞ST 組。CⅡ為：C 組＞HT 組＞MT 組＞LT 組＞ST 組。CⅢ為：ST 組＞LT 組＞MT 組＞C 組＞HT 組。CⅣ為：LT 組＞ST 組＞C 組＞HT組＞MT組（表3）。

2.5 骨骼肌線粒體CⅠ～Ⅳ活性比較

骨骼肌線粒體CⅠ活性，與C 組相比，ST 組顯著升高71.65%（P＜0.01），LT 組和MT 組均顯著下降，分別下降24.18%（P＜0.05）和44.51%（P＜0.01），HT 組升高1.84%，但無顯著性差異。與LT 組相比，HT 組和ST 組均顯著升高，分別升高 34.32%（P＜0.05）和126.4%（P＜0.01），MT 組顯著下降26.85%（P＜0.05）。與MT 組相比，HT 組和ST 組顯著升高（P＜0.01），分別升高83.62%和209.48%。與HT 組相比，ST 組顯著升高68.54%（P＜0.01）。

骨骼肌線粒體CⅡ活性，與C 組相比，ST 組顯著升高 51.17%（P＜0.01），MT 組顯著下降 26.25%（P＜0.05），LT 組升高6.02%，HT 組下降17.22%，但均無顯著性差異。與LT 組相比，ST 組顯著升高42.58%（P＜0.01），MT 組和 HT 組顯著下降（P＜0.05），分別下降30.44%和21.92%。與MT 組相比，ST 組顯著升高104.99%（P＜0.01），HT 組升高12.24%，但無顯著性差異。與HT組相比，ST組顯著升高82.63%（P＜0.01）。

表3 大鼠肝臟線粒體呼吸鏈復合體酶活性比較Table 3 Comparison of the activity of respiratory chain complexes in rat liver mitochondria

骨骼肌線粒體CⅢ活性，與C組相比，ST組顯著升高37.43%（P＜0.01），LT 組顯著下降34.12%（P＜0.01），MT組和HT組分別下降12.95%和6.33%，但均無顯著性差異。與LT組相比，MT組、HT組和ST組均顯著升高，分別升高 32.14%（P＜0.05），42.18%（P＜0.01）和108.61%（P＜0.01）。與 MT 組相比，ST 組顯著升高57.87%（P＜0.01），HT 組升高7.6%，但無顯著性差異。與HT組相比，ST組顯著升高46.72%（P＜0.01）。

骨骼肌線粒體CⅣ活性，與C組相比，LT組和MT組顯著下降（P＜0.01），分別下降41.57%和38.58%，HT 組升高14.85%，但無顯著性差異，ST 組顯著升高22.39%（P＜0.05）。與 LT 組相比，HT 組和 ST 組顯著升高45.72%（P＜0.05）和 109.45%（P＜0.01），MT 組升高5.11%，但無顯著性差異。與MT 組相比，HT 組和ST 組顯著升高38.64%（P＜0.05）和99.27%（P＜0.01）。與HT組相比，ST組顯著升高43.73%（P＜0.01）。

骨骼肌線粒體CⅠ～Ⅳ活性從高到低順序，CⅠ為：ST 組＞HT 組＞C 組＞LT 組＞MT 組。CⅡ為：ST組＞LT 組＞C 組＞HT 組＞MT 組。CⅢ為：ST 組＞C組＞HT 組＞MT 組＞LT 組。CⅣ為：ST 組＞C 組＞HT組＞MT組＞LT組（表4）。

表4 大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈復合體酶活性比較Table 4 Comparison of the activity of respiratory chain complexes in rat skeletal muscle mitochondria

3 討論

3.1 不同負荷運動訓練對大鼠體質(zhì)量的影響

體質(zhì)量可反映機體的營養(yǎng)和肌肉發(fā)育程度，是評價機體生長發(fā)育及健康狀況的重要指標。在運動訓練中，通過體質(zhì)量還可了解運動負荷的大小、訓練對機體的影響程度以及機體對訓練的適應狀況等。已有研究［13］表明，大鼠進行大強度耐力訓練7周，力竭運動后即刻，訓練組體質(zhì)量顯著低于安靜組。在過度訓練中，從第5 周開始至訓練結(jié)束，大鼠體質(zhì)量呈負增長，而安靜對照組在相應時期內(nèi)體質(zhì)量呈正增長［14］。在本文實驗條件下也出現(xiàn)類似結(jié)果，在極高負荷運動訓練中大鼠體質(zhì)量顯著下降，而低、中等和高負荷運動訓練對大鼠體質(zhì)量影響不顯著。以上研究說明，只有運動負荷達到一定值時才會明顯影響大鼠的體質(zhì)量，這可能是大負荷運動訓練導致機體代謝已有平衡被打破，重新建立新的平衡所致。

3.2 不同負荷運動訓練對大鼠肝臟及骨骼肌線粒體呼吸鏈復合體酶活性的影響

已有研究［15］表明，某些呼吸鏈復合體酶活性的變化有利于運動中細胞穩(wěn)態(tài)的維持。長期規(guī)律的運動可改善骨骼肌細胞線粒體呼吸鏈復合體酶的活性，不同運動方式和持續(xù)時間會產(chǎn)生不同的變化效果［16］。

（1）低負荷運動訓練8 周可提高大鼠肝臟線粒體NADH 電子傳遞鏈起始酶（CⅠ）活性，但由于FADH2電子傳遞鏈起始酶（CⅡ）活性下降，從而抵消了NADH 電子傳遞鏈起始酶活性的升高效應，致使其后的CⅢ和CⅣ活性無顯著性變化。呼吸鏈不同部位的復合體酶活性變化可能與運動負荷有關(guān)。大鼠骨骼肌線粒體CⅠ和CⅡ無顯著性變化，CⅢ和CⅣ活性顯著下降，致使線粒體呼吸鏈功能未能得到改善，反而有所下降。究其因，可能是低負荷運動主要動員股四頭肌中的慢肌纖維參與募集，而快肌纖維沒有或募集較少。低負荷運動可能打破了慢肌纖維原有的能量代謝平衡，經(jīng)8周運動訓練后仍無法良好適應。提示，通過低負荷運動訓練改善慢肌纖維的線粒體呼吸鏈功能，可能需要更長的訓練周期。本文結(jié)果還說明，肝臟組織線粒體呼吸鏈起始酶對低負荷運動訓練的應激反應較骨骼肌組織更敏感。

（2）中等負荷運動訓練8 周后，大鼠肝臟線粒體CⅢ活性顯著升高，CⅠ和CⅡ活性無顯著性變化，CⅣ活性顯著降低。已有研究認為，線粒體呼吸鏈的限速步驟是在細胞色素b-c1（CⅢ）。提示，中等負荷運動訓練可提高肝臟線粒體呼吸鏈的限速步驟，有望提高呼吸鏈功能。然而，呼吸鏈末端氧化酶（CⅣ）活性出現(xiàn)顯著降低，從而使呼吸鏈功能未能得到改善。對骨骼肌的相關(guān)研究［17］已有報道，有氧運動2 周可使大鼠骨骼肌CⅠ的活性增強，4周后CⅠ的活性仍在增強，其作用機制可能與新生過氧化氫分子的減少有關(guān)；6 周后，CⅠ的活性下降。耐力運動在短期（4 周）內(nèi)可在一定程度上增加大鼠股直肌線粒體CI的活性，而長期（6～8周）運動只能使其活性維持在較高水平，并不能有所突破；在短期（4 周）內(nèi)還可提高CⅣ活性，6周時顯著提高，8周后有下降趨勢；耐力訓練無法使訓練效果得到長期的突破，對于不斷提高運動成績不夠理想，可能需要按周期階梯式增加耐力訓練強度，才能使線粒體功能得到提升［18］。本文中8 周中等負荷運動后，大鼠骨骼肌線粒體CⅠ和CⅣ活性顯著下降，CⅡ和CⅢ活性無顯著性變化。這可能與在中等負荷運動中主要動員慢肌纖維參與收縮有關(guān)。對于提高慢肌纖維線粒體呼吸鏈功能而言，中等負荷運動刺激可能還較低，使骨骼肌無法產(chǎn)生良好的適應。本文結(jié)果還顯示，中等負荷運動訓練后，肝臟線粒體CⅢ活性顯著升高，骨骼肌線粒體CⅢ活性無顯著性變化，說明肝臟線粒體呼吸鏈限速步驟對中等負荷運動的應激反應較骨骼肌敏感。另外，骨骼肌線粒體呼吸鏈氧化酶（CⅣ）變化趨勢與肝臟一致，這可能與中等負荷運動訓練后機體有氧代謝增強，導致電子漏增多，過氧化損傷增加有關(guān)。

（3）高負荷運動訓練8周后，肝臟線粒體CⅠ活性顯著升高，CⅡ活性無顯著性變化，CⅢ和CⅣ活性顯著降低。提示：僅提高運動訓練負荷無法達到改善肝臟線粒體呼吸鏈功能的目的；呼吸鏈起始酶活性升高，并不意味其后的酶活性也一定會升高，其機制還有待進一步研究。高負荷運動訓練8 周后，骨骼肌線粒體CⅠ～Ⅳ活性均無顯著性變化。究其因，可能與在高負荷運動訓練中，股四頭肌慢肌纖維募集減少，主要募集快肌纖維參與收縮有關(guān)。欲募集更多快肌纖維參與收縮以及進一步提高骨骼肌線粒體呼吸鏈功能，可能還需加大運動訓練負荷。比較高負荷運動訓練對肝臟和骨骼肌線粒體呼吸鏈功能的影響，可以看出，高負荷運動訓練對不同器官線粒體呼吸鏈功能的影響不同，這與不同器官對運動負荷的敏感性不同有關(guān)，對骨骼肌而言，可能還與肌纖維的募集類型和比例有關(guān)。

（4）極高負荷運動訓練8 周后，大鼠肝臟線粒體CⅠ和CⅡ活性顯著下降，CⅢ和CⅣ活性無顯著性變化。提示，極高負荷的運動訓練會導致肝臟線粒體呼吸鏈起始酶損傷，對改善呼吸鏈功能無幫助。大鼠骨骼肌線粒體CⅠ～Ⅳ活性均顯著提高，說明極高負荷運動訓練可有效提高骨骼肌線粒體呼吸鏈功能，從而達到提高機體有氧工作能力的目的。其機制可能為，極高負荷運動時募集大量快肌纖維參與收縮，長期運動訓練使快肌纖維有氧工作能力得到適應性提高。已有研究可作為佐證，定期高強度耐力訓練可增強運動員股外側(cè)肌線粒體氧化碳水化合物的最大能力，并誘導線粒體CⅠ水平的特異性適應［15］。

（5）不同負荷運動訓練后，肝臟線粒體CⅠ～Ⅳ活性的變化規(guī)律為：CⅠ活性在低和高負荷條件下顯著升高，極高負荷條件下顯著下降，中等負荷條件下無顯著性變化。CⅡ活性在低和極高負荷條件下顯著下降，中等和高負荷條件下無顯著性變化。CⅢ活性在中等負荷條件下顯著升高，高負荷條件下顯著降低，低和極高負荷條件下無顯著性變化。CⅣ活性在中等和高負荷條件下顯著下降，低和極高負荷條件下無顯著性變化。由此可見，運動訓練對肝臟線粒體呼吸鏈功能的影響較復雜，影響呼吸鏈各部位酶活性的因素可能也不同。已有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體可能成為運動過勞性傷害的重要靶部位［19］，大強度游泳運動導致小鼠肝臟尤其是線粒體的結(jié)構(gòu)和功能損傷，線粒體呼吸控制比（RCR）顯著降低，通過補充姜黃素能顯著緩解其損傷［20］。這與本文中高負荷運動使肝臟線粒體CⅢ和CⅣ活性顯著降低，極高負荷運動使肝臟線粒體CⅠ和CⅡ活性顯著下降的結(jié)果類似。這說明，單靠運動訓練提高肝臟線粒體呼吸鏈功能的效果不佳，可能還需復合線粒體營養(yǎng)物質(zhì)［21］，其干預機制及相關(guān)信號通路還有待進一步研究。

（6）不同負荷運動訓練后，骨骼肌線粒體CⅠ～Ⅳ活性的變化規(guī)律為：CⅠ活性在極高負荷條件下顯著升高，高負荷條件下無顯著性變化，低、中等負荷條件下顯著下降；CⅡ活性在極高負荷條件下顯著升高，高、中等負荷條件下顯著下降，低負荷條件下無顯著性變化；CⅢ活性在極高負荷條件下顯著升高，高、中等負荷條件下無顯著性變化，低負荷條件下顯著下降；CⅣ活性在極高負荷條件下顯著升高，低、中等負荷條件下顯著下降，高負荷條件下無顯著性變化。就本文研究方案而言，通過運動訓練改善骨骼肌線粒體呼吸鏈功能是可行的，且極高負荷運動訓練效果最佳。已有研究［22］表明，高強度間歇訓練能誘導骨骼肌代謝和性能適應，盡管總體運動量較低，但與傳統(tǒng)的耐力訓練相似；8 周高強度間歇性訓練及間歇+耐力訓練使大鼠股直肌線粒體CⅠ和CⅣ活性顯著提高，且間歇+耐力訓練效果較好［18］。本文研究結(jié)果提示，欲發(fā)展骨骼肌線粒體呼吸鏈功能，需極高負荷的運動訓練，或采取高強度間歇訓練復合中等強度耐力訓練。這可能與運動訓練使肌紅蛋白（myoglobin，Mb）增加，Mb 能增強CⅣ活性以改善線粒體呼吸能力［23］，呼吸鏈復合體質(zhì)量新分配給超復合體（supercomplexes，SCs）［24］，使運動后骨骼肌線粒體 SCs 含量增加有關(guān)［25］。其機制還有待進一步研究。

以上研究結(jié)果還提示，運動訓練對機體運動能力的影響是復雜的，競技運動能力可能是有極限的。

4 結(jié)論

運動訓練對線粒體能量代謝的影響具有組織差異性，低、中等、高及極高負荷運動訓練對改善肝臟線粒體能量代謝的效果不佳，極高負荷運動訓練在提高骨骼肌線粒體能量代謝方面效果較好。