童艷麗 黃冠 梅清華

[摘要] 目的 觀察云木香和印木香聯(lián)合吉非替尼對非小細胞肺癌表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）耐藥線蟲模型的影響，初步探討其主要有效成分。 方法 采用基因型人體化（LET-23：：hEGFR-TK[T790M- L858R]）的秀麗隱桿線蟲突變體jgIs25，確定云木香和印木香的有效抑制濃度，并利用高效液相色譜法（Hypersil BDS C18 250 mm×4.6 mm，5 μm，檢測波長：220 nm）初步確定其有效活性成分。 結果 當印木香濃度在100～750 μg/mL、云木香濃度在500～750 μg/mL時，對秀麗隱桿線蟲突變體jgIs25陰門表達影響的差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），初步推測活性單體為木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯。 結論 木香聯(lián)合吉非替尼可逆轉非小細胞肺癌EGFR-TKI耐藥，為后續(xù)臨床研究提供基礎。

[關鍵詞] 木香;非小細胞肺癌;表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑;線蟲

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）08（a）-0029-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Saussurea costus and Indian costus combined with Gefitinib on the model of C. elegans which was resistant to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors （EGFR-TKI）， and to research the main effective active components. Methods Genotyped anthropogenic （LET-23：：hEGFR-TK[T790M- L858R]） C. elegans mutant jgIs25 was used to ensure the effective inhibitory concentration of Saussurea costus and Indian costus. The effective active components were preliminarily determined by HPLC （Hypersil BDS C18 250 mm×4.6 mm， 5 μm， detection wavelength： 220 nm）. Results There were significant differences in the vulva expression of C. elegans jgIs25， when the concentration of Indian costus was 100-750 μg/mL and Saussurea costus was 500-750 μg/mL （P < 0.01）. It was preliminarily speculated that the active monomers were costunolide and dehydrocostus lactone. Conclusion Radix Aucklandiae combined with Gefitinib can reverse EGFR-TKI resistance in non-small cell lung cancer. It can provide the basis for the follow-up clinical research.

[Key words] Radix Aucklandiae; Non-small cell lung cancer; Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors; C. elegans

一代表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）是晚期非小細胞肺癌的一線靶向治療藥物，但多在患者中位生存時間9個月后出現(xiàn)耐藥，主要由于EGFR20外顯子T790M發(fā)生突變（約占50%[1-2]）。針對上述耐藥機制，國外三代不可逆EGFR-TKI（目前僅有一種新藥奧西替尼上市[3]）奧西替尼對T790M突變患者具有較好的反應率，相對于無突變患者，中位無進展生存期為9.6～13.5個月[4-10]，但臨床治療費用高，并不能使經(jīng)濟狀況一般的患者從中獲益。中藥的生物活性化合物的發(fā)掘是新藥研發(fā)的來源之一[11-18]。秀麗隱桿線蟲與哺乳動物EGFR信號通路同源[19]，利用此線蟲構建基因型為LET-23：：hEGFR-TK[T790M-L858R]的秀麗隱桿線蟲突變體jgIs25，可以用于中藥逆轉肺癌耐藥的藥效篩選模型。

1 材料與方法

1.1 材料

線蟲模型：基因型LET-23：：hEGFR-TK[T790M-L858R]的秀麗隱桿線蟲突變體jgIs25，由韓國國家癌癥研究中心Jaegal Shim教授贈送。印木香購自Med Com for Trading & Import. Co.， Ltd;云木香購自廣東天成藥業(yè)有限公司（分別經(jīng)過廣東省第二人民醫(yī)院副主任中藥師陳燕鑒定為印木香和云木香）。二甲基亞砜（DMSO）購自上海阿拉丁試劑公司;瓊脂粉和蛋白胨購自上海國藥集團化學試劑有限公司;吉非替尼（420019，CAS 184475-35-2）、木香烴內(nèi)酯（111524）、綠原酸（110753）和咖啡酸（110885）等對照品為中國食品藥品檢定研究院出品;去氫木香內(nèi)酯對照品（A0301）購自北京中科質(zhì)檢生物技術有限公司;疊氮化鈉、磷酸、甲醇、乙醇等試劑均為分析純，購自廣州化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物的制備? 取印木香和云木香研磨成粉末，過40目篩網(wǎng)，精密稱取10 g，100 mL 70%乙醇加熱回流1 h，4000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，殘渣加70%乙醇繼續(xù)加熱回流1 h，將2次所得上清液轉移至250 mL的圓底燒瓶中，旋蒸至膏狀，取出，置于冷凍干燥箱中，干燥24 h，將粉末置于-20℃冰箱中保存待用。

1.2.2 液體板的制備? 將L1期的秀麗隱桿線蟲突變體jgIs25離心濃縮，平鋪于48孔板中，每孔終濃度為20只/200 μL。實驗組加入吉非替尼和不同濃度的中藥提取物，對照組單獨加入吉非替尼，兩組吉非替尼終濃度為5 μm。印木香和云木香提取物的終濃度50～4000 μg/mL。將制備好的48孔板置入20℃恒溫搖床中培養(yǎng)72 h至L4期，每個實驗組重復3次。

1.2.3 秀麗隱桿線蟲突變體jgIs25陰門表達的觀察? 將48孔板中處于L4期線蟲液體移至EP管中，離心，移除上清液，加入2 mmol/L疊氮化鈉溶液麻醉后移至浮游生物計數(shù)板上，在倒置顯微鏡下觀察并計算秀麗隱桿線蟲突變體jgIs25陰門表達的比例。

1.2.4 色譜條件? 色譜柱：大連依利特BDS C18色譜柱（Hypersil BDS C18）（250 mm×4.6 mm，5 μm）;檢測波長：220 nm;流速：1 mL/min;流動相：A. 0.1%磷酸水溶液，B.甲醇（0 min，90% A;15 min，60% A;60 min 30% A;80 min 10% A）;進樣量20 μL。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖表繪制使用origin 8.5。采用SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA），進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 印木香和云木香提取物對秀麗隱桿線蟲突變體jgIs25陰門表達的影響

與對照組（control）比較，當印木香濃度在100～750 μg/mL、云木香濃度在500～750 μg/mL時，對陰門表達的影響差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。見圖1～2。

2.2 指紋圖譜

用甲醇配制木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、綠原酸和咖啡酸對照品混合溶液，濃度均為0.1 mg/mL。采用相同的高效液相色譜條件對對照品溶液、印木香和云木香提取物溶液進行分析，印木香和云木香提取物的4種主要成分的出峰時間與對照品一致。見圖3～5。

1.綠原酸;2.咖啡酸;3.木香烴內(nèi)酯;4.去氫木香內(nèi)酯

1.綠原酸;2.咖啡酸;3.木香烴內(nèi)酯;4.去氫木香內(nèi)酯

1.綠原酸;2.咖啡酸;3.木香烴內(nèi)酯;4.去氫木香內(nèi)酯

3 討論

本研究采用線蟲模型，其具有人體類似EGFR-Ras-MAPK信號通路，通過轉基因技術構建模擬針對非小細胞肺癌一代EGFR-TKI耐藥患者（同時具備EGFR-TK21外顯子L858點突變和20外顯子T790出現(xiàn)突變）的線蟲模型（秀麗隱桿線蟲突變體jgIs25），篩選可逆轉一代EGFR-TKI代表藥物吉非替尼耐藥的中藥，發(fā)現(xiàn)云木香和印木香在500～750 μg/mL濃度范圍內(nèi)可對突變基因表達產(chǎn)生抑制作用，恢復吉非替尼對耐藥基因的敏感性。實驗采用綠原酸、咖啡酸、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯作為對照品，對實驗用印木香和云木香進行了指紋圖譜鑒定，通過指紋圖譜發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯占主要成分。吳蒙等[20]研究發(fā)現(xiàn)，木香內(nèi)酯可抑制肺癌細胞H460生長，因此推測兩者與抑制秀麗隱桿線蟲突變體陰門的表達有較大關系。本實驗通過對印木香和云木香提取物進行研究，提示中藥能夠逆轉吉非替尼這類EGFR-TKI的肺癌耐藥，豐富了祖國中醫(yī)中藥的抗癌理論。

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（收稿日期：2019-10-10）