楊宏艷 都曉輝 包亞男

[摘要] 目的 觀察膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑U18666A（UA）對(duì)星形膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞淀粉樣前體蛋白（APP）代謝及β淀粉樣蛋白（Aβ）生成的影響。 方法 0、1、3、5 μg/mL UA 作用U373細(xì)胞24 h，或5 μg/mL UA與U373細(xì)胞共培養(yǎng)0、12、24、48 h，Western blot檢測APP及其代謝產(chǎn)物α-CTF、β-CTF的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)Aβ1-40含量，熒光酶法檢測β-分泌酶活性。 結(jié)果 3、5 μg/mL UA組APP蛋白表達(dá)水平、β-CTF和α-CTF蛋白表達(dá)量、Aβ1-40含量高于0 μg/mL UA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。共培養(yǎng)24、48 h組APP表達(dá)水平、β-CTF和α-CTF蛋白表達(dá)量、Aβ1-40含量高于共培養(yǎng)0 h組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。5 μg/mL UA組β-分泌酶活性高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 UA通過增加β-分泌酶活性增強(qiáng)APP的表達(dá)和代謝，促進(jìn)Aβ1-40的生成，加速阿爾茨海默病進(jìn)程。

[關(guān)鍵詞] 膽固醇;U18666A;U373細(xì)胞;淀粉樣前體蛋白;β淀粉樣蛋白

[中圖分類號(hào)] R749.16? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）08（a）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of cholesterol transport inhibitor U18666A （UA） on amyloid precursor protein （APP） metabolism and β-amyloid protein （Aβ） generation in U373 cells of astroglioma. Methods U373 cells were treated with UA at the dose of zero， one， three and five μg/mL for 24 h or 5 μg/mL UA for different times （0， 12， 24， 48 h）. The expressions of APP and its metabolites α-CTF and β-CTF were detected using Western blot. The cellular levels of Aβ1-40 were measured with enzyme linked immunosorbent assay and the activity of β-secretase was determined by fluorescence assay. Results The expression levels of APP， α-CTF and β-CTF， and Aβ1-40 in 5 μg/mL UA group were higher than those in 0 μg/mL UA group， and the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The expression levels of APP， α-CTF and β-CTF， and Aβ1-40 in co-cultured 24 h and 48 h groups were significantly higher than those in co-cultured 0 h group， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. The activity of β-secretase in 5 μg/mL UA group was significantly higher than that in the control group （P < 0.01）. Conclusion UA enhances APP expression and metabolism by increasing β-secretase activity， promotes Aβ1-40 generation， accelerates the pathological process of Alzheimer′s disease.

[Key words] Cholesterol; U18666A; U373 cell; Amyloid precursor protein; β-amyloid protein

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，患者腦內(nèi)有明顯的β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積。Aβ主要由淀粉樣前體蛋白（APP）經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶水解產(chǎn)生[1-2]。膽固醇水平偏高患者AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯升高[3-6]，膽固醇代謝與AD關(guān)系是研究AD發(fā)病機(jī)制的一個(gè)熱點(diǎn)。本研究以星形膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞為研究對(duì)象，加入不同劑量膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑U18666A（UA）作用不同時(shí)間，觀察UA對(duì)U373細(xì)胞APP代謝及Aβ生成的影響，為進(jìn)一步理解膽固醇代謝與AD關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo 3001酶標(biāo)儀（Thermo）;Power Poc Basic電泳儀（Bio-Rad）;ChemiDoc MP全功能熒光化學(xué)發(fā)光成像儀（Bio-Rad）;UA[愛必信（上海）生物科技有限公司，MZ28];Y188抗體（Abcam，ab32136）;Aβ1-40試劑盒（Life Technologies，KHB3482）;β-分泌酶活性熒光檢測試劑盒（Abcam，ab65357）;β-actin抗體（ZM-0001）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（ZDR-5403）、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（ZB-2305）均購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)? U373細(xì)胞（上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心）培養(yǎng)在10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天換液一次。

1.2.2 分組藥物處理? 分別加入0、1、3、5 μg/mL UA作用U373細(xì)胞24 h或加入5 μg/mL UA作用U373細(xì)胞0、12、24 h和48 h。

1.2.3 Western blot測定蛋白表達(dá)? 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集細(xì)胞，按照本研究組前期實(shí)驗(yàn)[7]方法提取蛋白。配制10%分離膠和5%濃縮膠，加入等量蛋白樣品電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Y188（1∶3000）抗體，4℃孵育過夜。TBST洗3次，二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，TBST漂洗后顯影成像。Quantity-One軟件分析蛋白灰度。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測Aβ1-40含量? 收集各組細(xì)胞樣品，RIPA裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集沉淀。按試劑盒說明書操作，檢測450 nm各孔光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞內(nèi)Aβ1-40含量。每組2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.5 熒光法檢測β-分泌酶活性? 5 μg/mL UA作用U373細(xì)胞24 h，棄培養(yǎng)基，加入100 μL提取液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液。按試劑盒說明書依次加入樣品、反應(yīng)液和底物。樣品分為對(duì)照組、UA組、陰性對(duì)照組（加入抑制劑）、空白組（加入培養(yǎng)基）?；靹?，37℃避光孵育60 min，激發(fā)波長335 nm，發(fā)射波長495 nm處檢測各孔熒光強(qiáng)度，計(jì)算β-分泌酶活性。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UA對(duì)U373細(xì)胞APP蛋白表達(dá)的影響

0、1、3、5 μg/mL UA組APP蛋白表達(dá)量比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 20.05，P < 0.01）;3、5 μg/mL UA組APP蛋白表達(dá)水平高于0 μg/mL UA組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。共培養(yǎng)0、12、24 h和48 h組APP蛋白表達(dá)量比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 19.48，P < 0.01）;共培養(yǎng)24、48 h組APP蛋白表達(dá)水平高于共培養(yǎng)0 h組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖1。

2.2 UA對(duì)U373細(xì)胞APP代謝產(chǎn)物β-CTF和α-CTF含量的影響

0、1、3、5 μg/mL UA組β-CTF和α-CTF蛋白表達(dá)量比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 31.23，P < 0.01;F = 14.35，P < 0.01）;3、5 μg/mL UA組β-CTF和α-CTF蛋白表達(dá)量高于0 μg/mL UA組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。共培養(yǎng)0、12、24、48 h組β-CTF和α-CTF蛋白表達(dá)量比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 28.7，P < 0.01;F = 28.96，P < 0.01）。共培養(yǎng)24 h和48 h組β-CTF和α-CTF蛋白表達(dá)量高于共培養(yǎng)0 h組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2。

2.3 UA對(duì)U373細(xì)胞Aβ1-40含量的影響

0、1、3、5 μg/mL UA組Aβ1-40含量比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 9.181，P < 0.01）。1、3、5 μg/mL UA組Aβ1-40含量高于0 μg/mL UA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。共培養(yǎng)0、12、24 h和48 h組Aβ1-40含量比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 15.03， P < 0.01）。共培養(yǎng)24、48 h組Aβ1-40含量高于共培養(yǎng)0 h組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3。

2.4 UA對(duì)U373細(xì)胞β-分泌酶活性的影響

5 μg/mL UA組β-分泌酶活性高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 9.942，P < 0.01）。見圖4。

3 討論

膽固醇是真核細(xì)胞細(xì)胞膜的重要成分，能夠維持膜結(jié)構(gòu)完整性，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)展，維持突觸的彈性和功能，在AD的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[3，8-12]。高膽固醇飲食可以使AD動(dòng)物腦內(nèi)Aβ聚集增多，長期服用大劑量他汀類藥物可以改善臨床輕中度AD患者的認(rèn)知功能障礙[9，13]。AD患者及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腦中可見大量激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。高水平的膜膽固醇可提高胞漿鈣濃度，促進(jìn)Aβ生成，引起神經(jīng)細(xì)胞死亡[16]。UA可抑制膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，引起膽固醇在細(xì)胞內(nèi)蓄積[17-18]。本研究觀察了UA對(duì)星形膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞APP代謝的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，3、5 μg/mL UA組APP蛋白表達(dá)水平高于0 μg/mL UA組;共培養(yǎng)24、48 h組APP蛋白表達(dá)水平高于共培養(yǎng)0 h組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。提示UA通過改變膽固醇的水平和分布促進(jìn)APP的表達(dá)，與已有報(bào)道相符[19-20]。

Aβ生成過多和細(xì)胞外沉積是AD的主要病理特征之一。APP經(jīng)α-分泌酶水解生成可溶性多肽sAPPα和跨膜片段α-CTF，經(jīng)β-分泌酶水解生成sAPPβ和跨膜片段β-CTF，β-CTF繼續(xù)被γ-分泌酶水解生成Aβ1-40或Aβ1-42[2，19]。本研究結(jié)果顯示，3、5 μg/mL UA組β-CTF和α-CTF蛋白表達(dá)量、Aβ1-40含量高于0 μg/mL UA組;共培養(yǎng)24、48 h組β-CTF和α-CTF蛋白表達(dá)量、Aβ1-40含量高于共培養(yǎng)0 h組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。β-分泌酶是APP代謝中的關(guān)鍵酶，其含量和活性大小直接決定了Aβ的生成。本研究進(jìn)一步檢測了β-分泌酶的活性，結(jié)果顯示UA明顯增強(qiáng)U373細(xì)胞β-分泌酶的活性。

綜上所述，膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑UA增加U373細(xì)胞APP的表達(dá)，促進(jìn)APP代謝及Aβ生成，其機(jī)制與增強(qiáng)β-分泌酶活性有關(guān)。

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（收稿日期：2020-03-18）