宮宇,毛卓卓,史貴霞,楊中義,喻德躍,黃方

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

大豆是一種重要的蛋白質(zhì)來源,是人類生活中很重要的食物及營養(yǎng)來源之一。目前對蛋白質(zhì)的合成過程即轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)的研究有較大進步,但是對蛋白降解途徑研究較少[1]。真核細胞中蛋白質(zhì)的降解途徑主要包括溶酶體途徑、泛素蛋白酶體途徑和胱天蛋白酶途徑3種。其中泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是最有效的特異降解蛋白質(zhì)的途徑之一[2],而E3連接酶是該過程中泛素分子對靶蛋白進行特異性識別最關(guān)鍵的一類酶[3],負(fù)責(zé)識別特定靶標(biāo)蛋白的賴氨酸,將泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白并使之泛素化降解[4],從而在植物調(diào)控激素水平、生長發(fā)育以及抵抗非生物脅迫等過程中起重要作用[5-7]。例如水稻E3泛素連接酶基因OsDSG1的T-DNA插入突變體不僅延遲種子萌發(fā)、增強對高鹽和干旱脅迫的耐受性,而且在osdsg1突變體中,ABA 信號途徑基因和ABA 響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高[8]。

E3泛素連接酶主要分為3大類:HECT結(jié)構(gòu)域家族、RING結(jié)構(gòu)域家族及U-box蛋白家族[9]。其中,U-box 域是植物特有的一類高度保守的功能結(jié)構(gòu)域,由70多個氨基酸殘基構(gòu)成[10]。U-box結(jié)構(gòu)保守氨基酸的突變或替換都能導(dǎo)致 E3 泛素連接酶活性的喪失從而抑制泛素化。因而U-box 蛋白在UPP中扮演著至關(guān)重要的角色[11]。擬南芥中有63個U-box蛋白成員,在水稻基因組中鑒定出77個含有U-box結(jié)構(gòu)的蛋白[12],在大豆基因組中鑒定出128個U-box基因[13]。已有研究表明,植物U-box型E3泛素連接酶參與調(diào)控植物生長發(fā)育、生物及非生物脅迫響應(yīng)等過程。如擬南芥PUB30基因可調(diào)控植物耐鹽作用并受鹽脅迫誘導(dǎo),BKI1是PUB30發(fā)揮耐鹽功能的靶標(biāo),其通過促進BKI1的降解負(fù)調(diào)控耐鹽性,pub30突變體種子在萌發(fā)時對鹽脅迫更具耐受性[14]。水稻編碼U-box的 E3泛素連接酶基因OsPUB67受干旱、鹽、冷、JA和ABA顯著誘導(dǎo)且以ABA依賴性方式參與調(diào)控與非生物脅迫響應(yīng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的基因[15]。Wang等[13]發(fā)現(xiàn),與野生型相比,過表達GmPUB8的擬南芥種子在萌發(fā)和發(fā)芽后的生長對干旱和鹽脅迫的耐受性降低,植株葉片數(shù)量減少且GmPUB8以光周期依賴性方式調(diào)節(jié)開花時間。目前植物U-box型E3泛素連接酶的鑒定及功能研究已取得較大進展,但大豆中的報道只有極少數(shù)[13,16]。

Shi等[17]通過RNA-seq測序和轉(zhuǎn)錄組分析,篩選出‘南農(nóng)94-16’與其突變體(cco)2個樣本之間的差異表達基因,并利用半定量RT-PCR對15個差異表達基因在‘南農(nóng)94-16’和cco突變體開花后7 d的莢中進行驗證。在此基礎(chǔ)上,本研究挑選1個半定量RT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致的E3泛素連接酶基因GmPUB1,對其進行生物信息學(xué)分析。同時利用qRT-PCR技術(shù)對其在大豆不同生長發(fā)育時期、不同組織部位的表達量以及各種非生物脅迫處理條件下的表達模式進行分析。對過表達擬南芥表型以及種子中氨基酸含量進行測定并進行逆境脅迫下(ABA、PEG、NaCl)擬南芥種子萌發(fā)率統(tǒng)計。初步證明GmPUB1基因?qū)χ参镯憫?yīng)逆境脅迫以及種子生長發(fā)育具有一定的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株及試劑

大豆品種‘南農(nóng)94-16’由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心種質(zhì)資源庫提供,大豆子葉折疊突變體cco由本實驗室韓鎖義博士通過EMS、NaN3-60Cor自然誘變大豆栽培品種‘南農(nóng)94-16’而得,材料種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦實驗場。出苗后1個月左右,分別取‘南農(nóng)94-16’及突變體cco的根、莖、葉、花;之后掛牌分別取開花后7、10、15、30和40 d的種子,立即置于液氮中,再于超低溫冰箱保存待用。

采用擬南芥Columbia-0生態(tài)型種子作為供試材料,由本實驗室提供。

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購于北京天根生化科技有限公司。根癌農(nóng)桿菌EHA105及植物表達載體pMDC83由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心保存。連接載體pMD19-T克隆載體試劑盒購自TaKaRa公司。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自英駿生物技術(shù)有限公司。凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。Taq聚合酶和DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品購自全式金公司?？敲顾?Kan)、潮霉素B(HygB)、利福平(Rif)等購自鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 GmPUB1基因的克隆

使用北京天根生化科技公司的RNA Total RNA Kit(離心柱型)DP419試劑盒提取大豆幼嫩葉片的RNA,將提取的RNA利用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒(保存于-20 ℃)進行cDNA第1鏈的合成,所用的移液器Tips及PCR管無RNase。利用Phytozome數(shù)據(jù)庫得到其完整的基因序列,以大豆嫩葉的cDNA為模板,進行PCR擴增。設(shè)計擴增引物:GmPUB1F1:5′-ATGTAGCACAAAGCAGGTAGT-3′,GmPUB1R1:5′-AGGTCCGTATGTCTCAAATCTA-3′。

PCR產(chǎn)物在加入5 μL 10×loading buffer后,用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測,將分離出的目的條帶進行切膠、純化后檢測濃度。膠回收產(chǎn)物首先用Taq酶加A尾,取適量與pMD19-T Vector 4 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,涂布帶有抗性的平板,培養(yǎng)后挑取單克隆。PCR鑒定結(jié)果為陽性的菌液進行測序驗證,從而獲得基因完整的序列信息。保存菌液以進行下一步試驗。

1.3 GmPUB1基因的生物信息學(xué)分析

通過Phytozome網(wǎng)站(http://www.phytozome.net/soybean),下載基因的CDS序列、氨基酸序列及其部分同源基因的蛋白序列,用軟件BioXM 2.6預(yù)測蛋白分子質(zhì)量和等電點,用Clustal X2.0進行多序列同源對比,利用MEGA 5軟件進行系統(tǒng)進化樹分析,通過TargetP軟件預(yù)測蛋白在細胞內(nèi)的定位。

1.4 GmPUB1基因在不同組織中以及在不同脅迫處理下的表達分析

分別取突變體cco和‘南農(nóng)94-16’不同發(fā)育時期的組織器官,提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,進行qRT-PCR分析。根據(jù)大豆基因組Phytozome數(shù)據(jù)庫中該基因的CDS序列,利用Primer Premier 5.0設(shè)計熒光定量PCR引物,GmPUB1F2:5′-AATATTTGAAGGCATGGGTCTTG-3′,GmPUB1R2:5′-TGGTGTTGTCACTGCGAACA-3′。以大豆組成型表達基因Tubulin(GenBank No.:AY907703)作為內(nèi)參,其引物序列為:GmtubullinF:5′-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3′,GmtubullinR:5′-CACTTACGCATCACAT-AGCA-3′。使用Bio-Rad iQ5 real-time PCR儀進行熒光定量PCR,采用SYBR?Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo QPK-201,Japan)試劑。反應(yīng)體系:Real-time PCR Master Mix 25 μL,cDNA模板5 μL,上、下游引物各1 μL,補滅菌ddH2O至50 μL。PCR程序:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s,40個循環(huán);72 ℃延伸10 min終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線以及熔解曲線。

大豆幼苗的非生物脅迫和激素處理:將長勢一致的大豆‘Williams 82’幼苗置于1/2Hoagland營養(yǎng)液中預(yù)處理 3 d,之后進行不同處理。干旱處理:將幼苗轉(zhuǎn)移到15%的PEG3350水溶液中分別處理0、0.5、2 h;冷脅迫處理:將幼苗置于4 ℃分別處理2、4 h;鹽、JA和ABA處理:將幼苗分別轉(zhuǎn)移至250 mmol·L-1NaCl、50 mol·L-1JA和100 μmol·L-1ABA脅迫誘導(dǎo)3、6 h。對照材料置于水中分別處理 0、0.5、2、3、4和 6 h。所有處理分別采集植株葉片立即液氮冷凍,-80 ℃保存,供RNA提取使用。以大豆‘Williams 82’經(jīng)過非生物脅迫以及激素處理后的葉片cDNA為模板,以大豆組成型表達基因Tubulin為內(nèi)參,進行qRT-PCR分析。目的基因的相對表達量計算基于2-ΔΔCT法。

1.5 GmPUB1基因植物表達載體的構(gòu)建

利用上游引物GmPUB1F3:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGTTTTGTCATGGA-CAAA-3′和下游引物GmPUB1R3:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGAAGGGCTTCTTCAAA-TGCT-3′,以測序正確的連接有GmPUB1全長cDNA的pMD19-T載體質(zhì)粒為模板,擴增GmPUBP1基因的CDS序列。用Gateway系統(tǒng)的BP反應(yīng)將大豆GmPUB1基因CDS序列構(gòu)建到入門載體pDONRTM221上,將得到的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序,得到正確的序列后,提取質(zhì)粒進行LR反應(yīng),經(jīng)過重組交換使目的片段連接到表達載體pMDC83中,得到由35S啟動子驅(qū)動的含有目的基因的表達載體pMDC83-GmPUB1。菌液經(jīng)過PCR及酶切鑒定后,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞,挑取單克隆,培養(yǎng)后PCR檢測條帶大小正確無誤后,一部分菌液-80 ℃保存?zhèn)溆?一部分提取質(zhì)粒,存放于-20 ℃待用。

1.6 GmPUB1蛋白亞細胞定位分析

將新鮮的洋蔥內(nèi)表皮緊密貼合在MS固體培養(yǎng)基平板上,黑暗培養(yǎng)過夜。以測序正確的連接有全長GmPUB1cDNA的載體質(zhì)粒為模板,擴增GmPUB1基因的開放閱讀框(ORF),將ORF與GFP報告基因融合,形成1個GmPUB1-GFP的嵌合基因。質(zhì)粒包裹好金粉后利用基因槍法打入洋蔥表皮細胞中,基因槍轟擊后的洋蔥表皮在室溫暗環(huán)境下培養(yǎng)1 d后,利用Leica TCS SP2激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察GFP報告基因的定位情況。

1.7 蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥

將含有重組載體pMDC83-GmPUB1質(zhì)粒的陽性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌株劃線培養(yǎng)24 h后,接種于含有Kan、HygB、Rif的 YEB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng),當(dāng)D600值達到0.8～1.0后,離心收集菌液,加入含有0.3%表面活性劑Silwet的蔗糖溶液至D600=0.8左右。于擬南芥開花期,利用蘸花法將構(gòu)建的過表達載體pMDC83-GmPUB1轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,農(nóng)桿菌侵染當(dāng)代的植株為T0代。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性篩選及陽性苗鑒定

將收獲的T0代種子放入2 mL離心管中,用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇浸泡1 min,30% H2O2浸泡10 min,于超凈臺內(nèi)用滅菌水清洗干凈后,均勻種植于固體MS培養(yǎng)基(含50 mg·L-1Hyg B)上,置于人工智能培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d左右。植株生長正常的幼苗初步認(rèn)為陽性T1代植株。提取轉(zhuǎn)基因擬南芥及對照野生型擬南芥植株的DNA。取1 μL DNA為模板,以構(gòu)建過表達載體時的引物(GmPUB1F3和GmPUB1R3)進行PCR鑒定。設(shè)置含有GmPUB1基因CDS的質(zhì)粒為陽性對照,野生型擬南芥的DNA為陰性對照。T1代植株單株收獲,繼續(xù)種于含有HygB抗性的平板上篩選至T3代。

以T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型葉片cDNA為模板,擬南芥組成型表達基因Tubulin(GenBank ID:AT5G62690)為內(nèi)參,檢測GmPUB1基因表達情況。

1.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥千粒質(zhì)量和氨基酸含量測定

待T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥成熟后,將種子放入2 mL離心管中,置于30 ℃烘箱中烘1周以上,而后進行轉(zhuǎn)基因種子千粒質(zhì)量和氨基酸含量的測定。稱取至少0.12 g的擬南芥種子于液氮中研磨后加入5 mL HCl浸提液過濾后定容至10 mL;加入4%(體積分?jǐn)?shù))磺基水楊酸,15 000 r·min-1離心15 min,取上清液,于氨基酸分析儀(L-8900)測定氨基酸含量。每個樣品重復(fù)3次。

1.10 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在不同脅迫處理下的萌發(fā)率

選取3個株系的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型種子,用70%乙醇浸泡1 min,30%H2O2浸泡10 min,于超凈臺內(nèi)用滅菌水清洗干凈后,在含有70 mmol·L-1NaCl、6%PEG和0.1 μmol·L-1ABA的MS固體培養(yǎng)基上進行非生物脅迫,重復(fù)3次,7 d后統(tǒng)計萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmPUB1基因cDNA全長的克隆

以‘南農(nóng)94-16’嫩葉的cDNA為模板進行PCR擴增,得到長度為1 320 bp的DNA片段。測序結(jié)果與Phytozome中大豆Glyma.14g212200的CDS序列完全一致,即目的基因克隆成功,將該基因命名為GmPUB1(圖1)。

2.2 GmPUB1基因的生物信息學(xué)分析

ExPASy proteomics 網(wǎng)站分析表明,GmPUB1基因編碼439個氨基酸,GmPUB1蛋白的相對分子質(zhì)量為48.63×103,等電點為8.35。將GmPUB1蛋白氨基酸序列與其他植物 U-box 同源蛋白氨基酸序列進行比對,發(fā)現(xiàn)在保守結(jié)構(gòu)域高度相似(圖2)。將擬南芥、苜蓿、水稻、玉米和菜豆中的U-box蛋白與GmPUB1構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果(圖3)顯示,GmPUB1與擬南芥的AT1G66160、菜豆的Phvul.008G238500、苜蓿的Medtr5g077510同源,與菜豆中的Phvul.008G238500和大豆中的Glyma.02G242900聚為一枝,表明他們的親緣關(guān)系最近。

2.3 GmPUB1基因在不同組織以及不同脅迫處理下的表達分析

從圖4可見:GmPUB1在大豆各個組織中都有表達,但是在對照野生型和cco突變體中表達量不一致,在cco突變體開花后40 d的種子中表達量顯著高于野生型,這與前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相符[17]。而且在種子后熟期GmPUB1的表達量較高,在開花后30 d的種子中表達量最高,說明GmPUB1基因可能在種子發(fā)育后期發(fā)揮作用。

在PEG3350處理0.5 h時GmPUB1表達量極顯著高于其他時間(圖5-A)。在低溫處理2和4 h,GmPUB1表達量均顯著升高(圖5-B)。在NaCl處理3 h時,GmPUB1表達量最大,隨后下降;GmPUB1基因表達量在JA處理3和 6 h上升;ABA脅迫處理3 h時,GmPUB1表達量顯著降低,之后表達量回升(圖5-C)。以上結(jié)果表明,GmPUB1基因表達量受PEG、NaCl和低溫的誘導(dǎo),但在ABA處理時表達量降低。推測該基因可能參與了大豆響應(yīng)非生物脅迫的調(diào)控過程。

2.4 GmPUB1蛋白的亞細胞定位分析

從圖6可見:pMDC83-GFP綠色熒光分布在整個洋蔥表皮細胞中(圖6-A),轉(zhuǎn)入pMDC83-GmPUB1-GFP的洋蔥表皮細胞中也均有綠色熒光蛋白的存在(圖6-B)。表明GmPUB1融合蛋白在整個細胞中都有表達。

2.5 轉(zhuǎn)GmPUB1基因擬南芥陽性植株的PCR檢測

提取8株具有潮霉素抗性的T1代GmPUB1轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型的葉片DNA進行PCR檢測,以目的基因GmPUB1上、下游引物進行PCR擴增。以pMDC83-GmPUB1重組質(zhì)粒為陽性對照,以野生型擬南芥DNA及滅菌水作為陰性對照。結(jié)果如圖7所示,陰性對照沒有條帶,陽性對照及轉(zhuǎn)基因植株中有1條 1 320 bp的條帶,說明外源GmPUB1已經(jīng)成功插入到擬南芥的基因組中。

提取T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥RNA,進行熒光定量分析,檢測GmPUB1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的相對表達量。結(jié)果如圖8所示,不同轉(zhuǎn)基因株系中均有GmPUB1基因的表達。

2.6 GmPUB1過表達擬南芥千粒質(zhì)量和氨基酸含量變化

GmPUB1轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代表型與野生型相比并無明顯變化。表達量較高的3個株系OE-4、OE-5、OE-6的千粒質(zhì)量比野生型顯著提高(圖9),且3個株系氨基酸含量發(fā)生改變,尤其是甲硫氨酸含量顯著提高(圖10),表明異源表達GmPUB1對擬南芥種子的發(fā)育產(chǎn)生了一定的影響。

2.7 GmPUB1過表達擬南芥種子萌發(fā)率統(tǒng)計

從圖11可見:未進行生物脅迫處理的GmPUB1轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率顯著低于野生型(圖11-A)。在NaCl、PEG3350和ABA處理后,GmPUB1過表達株系和野生型的萌發(fā)率均顯著降低。NaCl處理后,3個轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率與未處理時相比分別降低22.6%、24.0%和24.3%,野生型降低27.0%;PEG處理下,轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)率比未處理時分別降低7.8%、19.1%和23.1%,野生型降低7.2%;在ABA處理下,3個轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率比未處理時分別降低8.4%、24.6%和10.7%,WT降低10.3%(圖11-B)。以上結(jié)果表明GmPUB1基因參與種子萌發(fā)進程且過表達GmPUB1對干旱以及ABA處理更敏感,而對鹽處理更具耐受性。

3 討論

Shi等[17]對野生型(WT)和cco突變體7 d的莢進行RNA-seq分析,發(fā)現(xiàn)WT和cco突變體中存在多個差異表達基因,其中GmPUB1基因在cco中的表達量顯著高于WT;通過半定量RT-PCR分析其在野生型和cco突變體7 d莢中的表達情況,發(fā)現(xiàn)GmPUB1基因在cco中的表達量高于WT。本研究對GmPUB1基因進行進一步的組織表達分析,發(fā)現(xiàn)該基因在突變體開花后40 d的種子中表達量明顯高于對照,且在WT和cco的不同組織中存在差異表達,這也進一步驗證了RNA-seq結(jié)果的準(zhǔn)確性。

U-box型E3泛素連接酶基因在逆境脅迫和激素應(yīng)答等方面起重要作用[18]。擬南芥AtPUB19基因過表達可導(dǎo)致植株對ABA敏感性和抗旱性減弱,atpub19突變體的干旱脅迫標(biāo)記基因RAB18、ADH1、COR47、RD22和RD29A的表達量在干旱脅迫下顯著高于野生型,AtPUB19可能是依賴ABA信號途徑負(fù)調(diào)控植物抗旱性[19]。Park等[20]發(fā)現(xiàn)U-box型E3泛素連接酶基因OsPUB15在H2O2、鹽、干旱脅迫下,表達水平明顯升高,在高鹽條件下OsPUB15過表達植株長勢比野生型好。本研究中GmPUB1基因?qū)Ω珊?、低溫、鹽以及JA和ABA處理均有響應(yīng),在NaCl、低溫、JA處理下呈極顯著上調(diào)趨勢;在PEG3350處理下呈先上升再下降趨勢;在ABA處理下,表達量極顯著下降。另外,NaCl、PEG和ABA處理后轉(zhuǎn)GmPUB1基因的擬南芥株系和WT種子萌發(fā)率都降低,但在NaCl處理時,轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率下降程度低于WT;而在PEG和ABA處理后,種子萌發(fā)率下降程度高于WT。綜上所述,大豆E3泛素連接酶基因GmPUB1可能參與逆境脅迫,并正調(diào)控鹽脅迫而負(fù)調(diào)控干旱脅迫,且可能通過ABA等激素途徑參與大豆非生物脅迫應(yīng)答,但具體調(diào)控機制還有待進一步研究。

E3泛素連接酶基因在植物生長發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用,包括參與花發(fā)育、植物衰老、種子萌發(fā)等。研究發(fā)現(xiàn),水稻E3連接酶基因OsPUB15是生長發(fā)育過程中的正調(diào)控因子,OsPUB15的T-DNA插入突變引起水稻嚴(yán)重的生長遲緩和幼苗致死表型,突變體種子不產(chǎn)生初生根,并且枝條發(fā)育顯著延遲[20]。Braumann等[21]發(fā)現(xiàn)半矮麥brh2和ari-l突變體由于缺失U-box E3泛素連接酶而發(fā)生矮化。擬南芥U-box蛋白基因PUB13參與調(diào)節(jié)擬南芥的花期,該基因T-DNA插入突變體后CO和FT基因上調(diào)表達,抑制FLC基因表達,突變體表現(xiàn)出在中長日照條件下的早期開花現(xiàn)象[22]。Shi等[17]的研究表明,突變體cco種子的百粒質(zhì)量和萌發(fā)率顯著低于對照,水解氨基酸含量顯著提高。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因進入植物細胞后能夠借助植物細胞的系統(tǒng)進行復(fù)制、整合和表達,是與核DNA基因完全相同的穩(wěn)定表達,遺傳穩(wěn)定性好[23],Bent[24]研究了通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥蘸花法獲得擬南芥株系后代,結(jié)果表明,其可以獲得大量穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系。因此,本研究選取了經(jīng)T3代檢測表達量較高的3個GmPUB1基因過表達擬南芥株系進行表型觀察,發(fā)現(xiàn)GmPUB1基因過表達擬南芥植株種子的萌發(fā)率顯著降低。同時,轉(zhuǎn)基因株系的千粒質(zhì)量極顯著提高,氨基酸含量發(fā)生改變。以上結(jié)果說明該基因參與調(diào)控種子的生長發(fā)育。本研究結(jié)果對探索大豆U-box型E3泛素連接酶基因參與調(diào)控植物生長發(fā)育以及逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的調(diào)控作用具有一定的意義。