馬水燕,王楠楠,董雨豪,劉錦,陸承平,劉永杰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是廣泛存在于水體環(huán)境中的革蘭陰性菌,可引起淡水魚(yú)的出血性敗血癥,也可感染人引發(fā)胃腸炎和敗血癥[1]。該菌的致病性與其產(chǎn)生的多種毒力因子如胞外蛋白酶、溶血素及外膜蛋白等密切相關(guān)[2]。此外,Ⅵ型分泌系統(tǒng)(type Ⅵ secretion system,T6SS)也是嗜水氣單胞菌重要的毒力因子[3]。

T6SS廣泛存在于革蘭陰性菌中,對(duì)細(xì)菌的致病性和環(huán)境適應(yīng)性有重要作用。功能性的T6SS一般是由13個(gè)保守的“核心”基因編碼的蛋白組裝成類似于倒置T4噬菌體的復(fù)雜結(jié)構(gòu),可以錨定在細(xì)胞膜上,通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白到原核細(xì)胞或真核細(xì)胞發(fā)揮毒力作用[4]。效應(yīng)蛋白的種類和功能復(fù)雜,通常使用質(zhì)譜分析、蛋白組學(xué)和突變體庫(kù)等方法鑒定。目前研究最多的是溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hcp)和纈氨酸谷氨酸重復(fù)蛋白(VgrG)[5],它們也是重要的結(jié)構(gòu)蛋白。近年來(lái)隨著生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,利用一些特征基因簇或保守結(jié)構(gòu)域如脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸(PAAR)重復(fù)蛋白[6]、未知功能結(jié)構(gòu)域4123(DUF4123)[7]等,已成功鑒定到多種效應(yīng)蛋白。Russell等[8]通過(guò)保守催化基序GxSxG鑒定出具有脂酶活性的效應(yīng)蛋白,命名為Ⅵ型脂酶效應(yīng)蛋白(Tle),并將其劃分為4個(gè)家族,即Tle1—Tle4。

嗜水氣單胞菌NJ-35株于2010年分離自江蘇省南京市浦口區(qū)某漁場(chǎng)的發(fā)病鯽魚(yú),基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其基因組內(nèi)有完整的T6SS基因簇。本課題組前期工作主要集中于Hcp蛋白的功能研究[9],未對(duì)其他潛在的效應(yīng)蛋白進(jìn)行鑒定。本研究利用生物信息學(xué)方法,在NJ-35基因組中尋找保守結(jié)構(gòu)域,通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)到假定的T6SS效應(yīng)蛋白Tle1AH,進(jìn)一步構(gòu)建基因缺失株及互補(bǔ)株,并測(cè)定其競(jìng)爭(zhēng)能力、生長(zhǎng)特性及毒力,研究結(jié)果為深入探討嗜水氣單胞菌T6SS致病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與試劑

嗜水氣單胞菌NJ-35、大腸桿菌SM10由本課題組分離保存;自殺性質(zhì)粒pYAK1、pMMB207由浙江大學(xué)方維煥教授饋贈(zèng)。Prime STAR DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA fragment Purification Kit均購(gòu)自大連TaKaRa公司;細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑、E.Z.N.A.TM細(xì)菌RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司;DNA Marker、DNA Gel Purification Kit、2×PCR Pre Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;氨芐青霉素(Amp)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan)均為Invitrogen產(chǎn)品。試驗(yàn)相關(guān)引物(表1)由蘇州金唯智科技有限公司合成。

表1 本試驗(yàn)所用引物信息

1.2 T6SS效應(yīng)蛋白的預(yù)測(cè)

參考已報(bào)道的保守結(jié)構(gòu)域DUF4123,對(duì)NJ-35株的全基因組序列進(jìn)行潛在的T6SS效應(yīng)蛋白搜索。使用Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線軟件預(yù)測(cè)特殊的結(jié)構(gòu)域,利用Geneious軟件人工比對(duì)催化基序生成序列標(biāo)識(shí)。

1.3 基因缺失株的構(gòu)建

利用同源重組技術(shù)構(gòu)建基因缺失株[10]。以NJ-35株基因組為模版,用上游片段引物(P1/P2)和下游片段引物(P3/P4)分別擴(kuò)增目的基因的上、下游同源臂。以上、下游產(chǎn)物為模版,使用P1/P4引物融合上、下游同源臂,再利用常規(guī)的酶切、連接,將融合片段連接到pYAK1載體并轉(zhuǎn)化宿主菌SM10。測(cè)序鑒定后進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

以含有自殺重組質(zhì)粒的大腸桿菌SM10為供體菌,嗜水氣單胞菌NJ-35為受體菌,通過(guò)菌毛接合的方式將重組質(zhì)粒從SM10轉(zhuǎn)移至NJ-35中。具體方法:2種菌均培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,5 000g離心5 min后棄上清液;用新鮮LB液體培養(yǎng)基洗2次,將2種菌濃度均調(diào)至1.0×108CFU·mL-1(A600=0.2),按照2∶1(體積比)的比例將SM10與NJ-35充分混勻。各取200 μL混合菌液滴加在鋪有0.45 μm孔徑無(wú)菌濾膜的LB固體培養(yǎng)基上,平板正放于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

無(wú)菌鑷子取出帶菌濾膜,吹打至1 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基,5 000g離心5 min,棄800 μL上清液,其余菌液涂布于含氨芐青霉素(Amp,100 μg·mL-1)和氯霉素(Cm,34 μg·mL-1)雙抗的LB平板上,28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～36 h。挑取單菌落于含有上述2種抗生素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜,提取基因組后用P1/P4引物進(jìn)行PCR鑒定,篩選第1次同源重組的菌株(單交換株)。

單交換株轉(zhuǎn)接至不含NaCl的LB培養(yǎng)基中,傳代3次后轉(zhuǎn)接至含200 g·L-1蔗糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h,菌液涂布含200 g·L-1蔗糖的LB固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后挑取單菌落于普通LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)6～8 h,提取基因組并進(jìn)行PCR驗(yàn)證,篩選第2次同源重組后丟失目的基因的菌株,即基因缺失株Δtle1AH。

1.4 基因互補(bǔ)株的構(gòu)建

以NJ-35株基因組為模版,用互補(bǔ)片段引物(P5/P6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得含有目的基因的片段,通過(guò)常規(guī)單酶切、連接、轉(zhuǎn)化,將片段產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMMB207(宿主菌為大腸桿菌SM10)。以含有互補(bǔ)質(zhì)粒的大腸桿菌SM10為供體菌,NJ-35株基因缺失株為受體菌,通過(guò)細(xì)菌接合將互補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至缺失株。接合完成后,用無(wú)菌鑷子取出帶菌濾膜,用1 mL新鮮的LB將濾膜上的菌體吹打至離心管中,5 000g離心 5 min,棄800 μL上清液,菌體重懸后涂布于含有雙抗(100 μg·mL-1Amp,34 μg·mL-1Cm)的LB平板上,倒置于28 ℃培養(yǎng)36～48 h。挑取單菌落于含有雙抗的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜,提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證,篩選含有互補(bǔ)質(zhì)粒的菌株,即基因互補(bǔ)株CΔtle1AH。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生株、缺失株及互補(bǔ)株的菌液,提取細(xì)菌RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄(RT)為 cDNA,采用SYBRPremixExTaqTMKit進(jìn)行qPCR,用tle1AH-RT-S/A引物檢測(cè)各菌株基因轉(zhuǎn)錄水平,并以aetY-RT-S/A作為內(nèi)參引物,采用2-ΔΔCT法計(jì)算各基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平[11]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

分別挑取野生株、缺失株和互補(bǔ)株的單菌落于LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。各菌株A600值調(diào)至0.5,以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至20 mL LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)。每隔 2 h 取3個(gè)平行樣本,測(cè)定A600值,繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 生物被膜形成能力和運(yùn)動(dòng)性測(cè)定

參考已報(bào)道的方法[12],挑取各菌株單菌落接種LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜。取菌液按1∶100轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用LB培養(yǎng)基將A600值調(diào)至0.1后再稀釋100倍。制備好的菌液按每孔200 μL加入無(wú)菌的96孔平底細(xì)胞板中,每株菌重復(fù)8孔。同時(shí)加8孔新鮮LB液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。細(xì)胞板在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)上清液,用無(wú)菌PBS清洗3次除去浮游菌體。然后,每孔加入200 μL甲醇固定菌體,15 min后棄去,室溫下干燥。向每孔加200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色,10 min后棄去并用ddH2O清洗5次。待完全干燥后向各孔加無(wú)水乙醇200 μL,溶解10 min,最后用酶標(biāo)儀測(cè)定A595值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

將上述A600=0.1的菌液各取1 μL輕輕垂直點(diǎn)于瓊脂含量3 000 mg·L-1的LB培養(yǎng)基表面,在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h后測(cè)量細(xì)菌圓形運(yùn)動(dòng)軌跡的直徑。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)

嗜水氣單胞菌與大腸桿菌的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)參照Macintyre等[13]的方法進(jìn)行。嗜水氣單胞菌NJ-35株有Amp抗性,大腸桿菌BL21含有pET-28a(+)載體,帶有卡那霉素抗性(Kanr)。2種菌分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后將A600值調(diào)為1.0,再濃縮至原來(lái)體積的1/10,將嗜水氣單胞菌各菌株菌液(5×109CFU·mL-1)與大腸桿菌菌液(5×109CFU·mL-1)按1∶1充分混勻,各取25 μL滴加于LB平板上的0.22 μm濾膜;同時(shí)LB液體培養(yǎng)基和等量大腸桿菌混勻作為對(duì)照。平板置于28 ℃溫箱培養(yǎng)3 h。取出帶菌濾膜,用1 mL LB液體培養(yǎng)基沖洗收集的菌體并倍比稀釋。取100 μL合適稀釋度菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)

參照Dong等[14]的方法,將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7按每孔4×105的細(xì)胞量接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后以PBS洗滌細(xì)胞3次后,加入400 μL DMEM待用,同時(shí)計(jì)數(shù)每孔中的細(xì)胞數(shù)量。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各菌株菌液,4 000g離心5 min,取沉淀用無(wú)菌PBS洗3次。向每孔細(xì)胞中加入100 μL細(xì)菌(4×106CFU·mL-1),使細(xì)菌與細(xì)胞的感染比例為1∶1,加入細(xì)菌后,800g離心細(xì)胞板10 min,使細(xì)菌集中到細(xì)胞表面。同時(shí)把菌懸液10倍比梯度稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù),以確定實(shí)際加入每孔的細(xì)菌量。將細(xì)胞板置于28 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1 h,無(wú)菌PBS洗滌5次,加入含有100 μg·mL-1慶大霉素的DMEM,置于28 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,無(wú)菌PBS洗滌5次,然后加入1 mL細(xì)胞裂解液室溫裂解細(xì)胞10 min,吹打混勻,10倍比梯度稀釋后涂LB固體平板,取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 對(duì)斑馬魚(yú)半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定

LD50的測(cè)定參照Pang等[15]的方法。斑馬魚(yú)在室內(nèi)喂養(yǎng)1周并觀察狀態(tài),確認(rèn)良好后進(jìn)行試驗(yàn)。水溫保持在25～28 ℃。挑取各菌株單菌落于LB培養(yǎng)基中28 ℃過(guò)夜培養(yǎng),再1∶100轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,5 000g離心后棄上清液,菌體用無(wú)菌PBS洗3次,將菌液濃度分別調(diào)整為5×106、5×105、5×104、5×103、5×102CFU·mL-1。每個(gè)濃度注射10尾斑馬魚(yú),每尾0.02 mL,同時(shí)注射等量PBS設(shè)為空白對(duì)照。觀察記錄1周,按照Bliss算法[16]計(jì)算LD50。

1.11 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 2013和Graphpad prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用t測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行組間差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用DUF4123結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)潛在效應(yīng)蛋白

以DUF4123保守結(jié)構(gòu)域作為靶點(diǎn),在嗜水氣單胞菌NJ-35株中預(yù)測(cè)到潛在的效應(yīng)蛋白基因(圖1-A),發(fā)現(xiàn)該基因編碼具有水解酶活性的DUF2235結(jié)構(gòu)域,蛋白氨基酸序列含有典型的磷酸酶GxSxG催化位點(diǎn)(圖1-B),符合已鑒定效應(yīng)蛋白Tle磷脂酶家族的特點(diǎn),命名為T(mén)le1AH。

2.2 tle1AH基因缺失株和互補(bǔ)株的PCR鑒定及tle1AH基因轉(zhuǎn)錄的qPCR驗(yàn)證

重組缺失質(zhì)粒和互補(bǔ)質(zhì)粒序列經(jīng)NCBI BLAST在線比對(duì),確認(rèn)沒(méi)有堿基突變。用引物P1/P4對(duì)野生株和缺失株進(jìn)行PCR驗(yàn)證,野生株檢測(cè)到3 399 bp大小的產(chǎn)物,缺失株產(chǎn)物大小為1 401 bp,即成功缺失了1 998 bp目的片段。用目的基因內(nèi)部引物P5/P6進(jìn)一步驗(yàn)證,缺失株中不能檢測(cè)到條帶,而野生株有擴(kuò)增產(chǎn)物,說(shuō)明成功構(gòu)建了tle1AH單基因缺失株(圖2-A)。用互補(bǔ)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果表明在互補(bǔ)株中可以檢測(cè)到目的基因,說(shuō)明tle1AH基因回補(bǔ)成功(圖2-B)。連續(xù)傳10代后再次經(jīng)PCR檢測(cè),未發(fā)生回復(fù)突變。

采用qPCR對(duì)野生株、缺失株Δtle1AH和互補(bǔ)株CΔtle1AH進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)錄分析。結(jié)果顯示,Δtle1AH株無(wú)目的基因轉(zhuǎn)錄,而野生株和互補(bǔ)株中均有一定水平的轉(zhuǎn)錄(圖2-C)。

2.3 菌株的生長(zhǎng)曲線和運(yùn)動(dòng)性測(cè)定

NJ-35、Δtle1AH、CΔtle1AH在28 ℃條件下生長(zhǎng)速率(圖3-A)和運(yùn)動(dòng)性(圖3-B)沒(méi)有明顯差異,說(shuō)明敲除tle1AH基因并不影響嗜水氣單胞菌在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力和運(yùn)動(dòng)性。

2.4 菌株的競(jìng)爭(zhēng)能力驗(yàn)證

用大腸桿菌與嗜水氣單胞菌各菌株分別共培養(yǎng),檢測(cè)大腸桿菌存活數(shù)。結(jié)果顯示:與NJ-35株共培養(yǎng)時(shí),存活的大腸桿菌數(shù)量顯著降低;同時(shí)tle1AH基因的缺失顯著降低了NJ-35對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制能力(P<0.01),而互補(bǔ)株CΔtle1AH又能恢復(fù)到野生株的抑制水平(圖4)。表明Tle1AH在嗜水氣單胞菌抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用。

2.5 生物被膜形成能力測(cè)定

與野生株比較,缺失株的生物被膜形成能力顯著上升(P<0.05)(圖5),提示該基因除了參與細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)活動(dòng)外,也參與調(diào)控生物被膜形成。

2.6 巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)

巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬試驗(yàn)結(jié)果(圖6)表明:RAW264.7細(xì)胞對(duì)野生株和互補(bǔ)株的吞噬率分別為9%和8%,顯著低于對(duì)缺失株的吞噬率(38.7%)(P<0.05),說(shuō)明tle1AH缺失可導(dǎo)致嗜水氣單胞菌抗吞噬能力明顯降低。

2.7 菌株對(duì)斑馬魚(yú)LD50的測(cè)定

試驗(yàn)組感染細(xì)菌24 h后開(kāi)始出現(xiàn)死亡,對(duì)照組斑馬魚(yú)在試驗(yàn)過(guò)程中均活動(dòng)正常,未出現(xiàn)臨床癥狀和死亡情況。發(fā)病的魚(yú)出現(xiàn)典型的臨床癥狀,身體側(cè)翻,腹部及鰭條明顯充血、出血,繼而死亡。對(duì)病死魚(yú)進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定,確定為嗜水氣單胞菌感染。統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組斑馬魚(yú)在 1周內(nèi)的死亡數(shù)量,按照Bliss法計(jì)算出野生株NJ-35的LD50值約為4.40×103CFU,缺失株Δtle1AH的LD50約為7.41×104CFU,互補(bǔ)株CΔtle1AH的LD50約為7.48×103CFU(圖7)。表明tle1AH基因在嗜水氣單胞菌NJ-35株毒力上發(fā)揮重要作用。

3 討論

細(xì)菌為了克服從胞質(zhì)向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的困難,進(jìn)化出多種不同類型的蛋白分泌系統(tǒng)。革蘭陰性菌中至少存在6種蛋白分泌系統(tǒng)(T1SS—T6SS),其中分布廣泛的T6SS在細(xì)菌的致病和環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]。目前已經(jīng)鑒定的效應(yīng)蛋白種類和功能復(fù)雜,基于作用靶標(biāo)分為3類,分別靶向細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和核酸[18]。Tle1—Tle4家族除了保守的催化基序外,與其他已知的脂肪酶無(wú)明顯的序列同源性。本研究分析AH17550的氨基酸序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有GxSxG催化基序,且在其C端存在T6SS效應(yīng)蛋白常見(jiàn)的DUF2235結(jié)構(gòu)域[19],該基因上游還存在目前公認(rèn)的效應(yīng)蛋白基因hcp和VgrG,因此推測(cè)AH17550很可能是一種潛在的脂質(zhì)水解酶型T6SS效應(yīng)分子,將其命名為T(mén)le1AH。

為進(jìn)一步分析tle1AH基因的功能,本試驗(yàn)成功構(gòu)建tle1AH缺失株及相應(yīng)互補(bǔ)株,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析。tle1AH缺失后,嗜水氣單胞菌對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制能力顯著降低,提示該基因參與細(xì)菌種間競(jìng)爭(zhēng),從而有助于增強(qiáng)細(xì)菌自身的環(huán)境適應(yīng)性。此外,tle1AH缺失可導(dǎo)致嗜水氣單胞菌抗巨噬細(xì)胞的吞噬能力及對(duì)斑馬魚(yú)的毒力作用均明顯降低,表明tle1AH在該菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道,Hcp和VgrG作為嗜水氣單胞菌SSU(現(xiàn)已更名為達(dá)卡氣單胞菌SSU)的重要T6SS效應(yīng)蛋白,除參與環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)外,還參與調(diào)控細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成及毒力特性[20]。Gallique等[21]研究表明,T6SS效應(yīng)蛋白的缺失可導(dǎo)致銅綠假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)生物被膜形成能力下降。本試驗(yàn)中tle1AH缺失則引起嗜水氣單胞菌NJ-35的生物被膜形成能力明顯增強(qiáng),但不影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。這些研究結(jié)果的差異可能與菌株的不同或效應(yīng)蛋白種類不同有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),NJ-35的T6SS效應(yīng)蛋白Hcp有3個(gè)基因拷貝,在生物被膜形成能力上發(fā)揮不同的作用:hcp1和hcp2基因缺失會(huì)導(dǎo)致生物被膜形成能力降低,而hcp3缺失則導(dǎo)致生物被膜形成能力增強(qiáng)[22]。因此,推測(cè)T6SS多種效應(yīng)蛋白在調(diào)控嗜水氣單胞菌生物被膜形成上可能存在相互協(xié)調(diào)作用。

效應(yīng)蛋白有一定的毒性作用,細(xì)菌為了避免對(duì)自身細(xì)胞的傷害,通常會(huì)在其下游編碼特異性同源免疫蛋白,從而中和毒素效應(yīng)[23]。本研究同樣在tle1AH基因下游預(yù)測(cè)到編碼假定免疫蛋白的基因。后續(xù)將著重研究tle1AH及相應(yīng)免疫蛋白的關(guān)系,并從蛋白層面上對(duì)Tle1AH功能開(kāi)展深入研究,以期更進(jìn)一步闡明Tle1AH在嗜水氣單胞菌生存及致病過(guò)程中的作用。