馬寧,劉艷霞,李想,陳雪,楊興明*

(1.南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院,江蘇 南京 210095;2.貴州省煙草科學研究院,貴州 貴陽 550000;3.貴州省煙草公司畢節(jié)分公司,貴州 畢節(jié) 551700)

植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)是指一類定殖在植物根際土壤,可促進植物生長的有益微生物[1]。大量研究表明,某些PGPR不僅能夠產生多種抗生素,如分泌氰化氫(HCN)[2],同時具有生物固氮[3]、溶磷[4]、解鉀[5]、分泌吲哚乙酸[6]等功能特性,可以促進植物生長和改善土壤的微生態(tài)環(huán)境[7-8]。因此,植物根際促生菌的研究越來越受到廣泛關注[9]。

目前,促生菌效果的評定一般憑研究者的經驗判斷,由于評判的指標較多,容易產生偏差。因此,指標權重的確定是一項重要工作。權重確定方法有很多,大致可分為主觀賦權法、客觀賦權法和組合賦權法。近年來,賦權法更是被廣泛應用于農作物品質分析中[10-13],可借鑒于篩選煙草促生菌。其中,熵權法是目前常用的一種客觀賦權法,其根據樣本數據信息確定指標權重,避免主觀性傾向的影響。熵權法以信息熵評價某項指標在不同評價對象中的差異程度,若某項指標的數據變幅很大,說明該指標提供的信息量大,相應的信息熵小,賦予的權重大;反之亦然。若某項指標的數據全部相等,說明該指標對評價對象無法提供區(qū)別信息,相應的信息熵最大,權重為零。該方法對評估指標數量沒有太大限制,適宜于煙草促生菌效果評價。本研究以煙草為供試材料,用實驗室前期分離篩選得到的25株菌株菌液灌根處理,分析接種促生菌對煙草生長的影響,并使用熵權法處理促生菌處理后煙草的生理指標,篩選高效的煙草根際促生菌,為煙草微生物肥料開發(fā)提供可靠材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)基

供試菌株為貴州省煙草科學研究院微生物實驗室前期從貴州煙區(qū)煙草根際分離篩選得的優(yōu)良菌株,共25株,保存于本實驗室,菌株分別為:PS-S、W1、VC48、L9、34、F2、L25、LX5、L4、VC108、F1、TD1、LX7、L16、LX4、VC110、BA-S、N1、L14、VC21、TLZZ、VC29、L2、114和VC109。煙草品種為‘K326’。

細菌活化和保存培養(yǎng)基:LB、NB培養(yǎng)基;放線菌活化和保存培養(yǎng)基:高氏1號合成培養(yǎng)基;檢測菌株固氮能力培養(yǎng)基:NFM培養(yǎng)基[14];檢測菌株溶磷能力培養(yǎng)基:PVK培養(yǎng)基[15];檢測菌株解鉀能力培養(yǎng)基:解鉀菌選擇培養(yǎng)基[16]。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株促生及產生植物激素能力的測定菌株的生物固氮[14]、產HCN[17]、溶磷[15]以及解鉀[16]能力采用相關文獻方法。采用ELISA定量檢測試劑盒(GENMED SCIENTIFICS INC.U.S.A)測定菌株的生長素含量[18]。

1.2.2 接種菌液的制備將甘油保存的供試菌株接入LB固體培養(yǎng)基,在28 ℃培養(yǎng)箱中放置24 h,然后用無菌水清洗菌體制成種子菌懸液。在250 mL三角瓶中裝入100 mL液體培養(yǎng)基,滅菌后接入2 mL種子菌懸液,28 ℃、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h,調整發(fā)酵液菌體含量為108CFU·g-1,即得菌種培養(yǎng)液,備用。

1.2.3 菌株對煙草的促生作用漂浮育苗:調節(jié)基質持水量后,加入已用福爾馬林溶液消毒的育苗盤,每穴2粒種子,苗池注水,待煙苗長至4～5葉期時移栽。移栽前要將所用基質濕熱滅菌,分裝到一次性杯子(底部扎孔)中,每盆裝0.1 kg基質,備用。移栽煙苗7 d后,分別用配制好的菌種培養(yǎng)液處理,每株煙苗接種量為10 mL,灌根處理,每個處理2株,對照處理使用等量無菌水。

每天觀察煙草的生長情況,每隔8 d拍照。培養(yǎng)25 d后,將煙苗整株挖出,洗去根部泥土,測定煙株農藝性狀,主要測定最大葉長、最大葉寬、株高、莖圍、總根長、根投影面積、根系活力[19]、地上部鮮質量等指標,具體參照《煙草農藝性狀調查方法:YC/T142—1998》。使用根系掃描儀(EPSON1680)及其配套的WinRhizo Pro 5.0根系分析軟件測定根系指標[20]。

1.2.4 熵權法綜合評價煙品質通過隸屬函數與因子分析對不同菌株處理下的煙草生長性狀進行綜合評價,熵權法確定權重,計算不同促生菌處理下煙草的得分。

隸屬函數值(Yij):

正向指標:Yij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(1)

負向指標:Yij=(Xjmax-Xij)/(Xjmax-Xjmin)

(2)

式中:i(i=1,2,…,n)為不同促生菌接菌處理;j(j=1,2,…,m)為煙草生長指標;Xij為第i菌株處理下煙草生長指標的數值;Yij為第i菌株處理下隸屬函數值。

第i菌株接菌處理第j項指標的比重(Pij):

(3)

信息熵(Ej)及其冗余度(Gj):

(4)

Gj=1-Ej

(5)

指標權重(Wj):

(6)

各指標評價得分(Zj):

(7)

1.3 數據處理與分析

采用Excel 2007軟件對數據初步計算,采用SPSS 22.0軟件進行數據顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 菌株促生及產植物激素能力測定

分別測定25株菌的5項促生指標(固氮能力、產HCN、溶磷能力、解鉀能力、分泌吲哚乙酸能力),結果見表1和圖1。由表1可見:菌株TD1、PS-S、L25、N1、VC109、BA-S和VC29不具備固氮能力,占供試菌株的32%;菌株L4、VC110、L2、114、VC109、VC29和L16不具備產HCN的能力,占供試菌株的28%;在溶磷能力上菌株LX7、L2、F1、BA-S、LX4、VC29、L9和VC108表現優(yōu)于其他菌株;在解鉀能力方面,菌株W1、PS-S、F2、34和VC108表現優(yōu)于其他菌株;供試菌株均能分泌吲哚乙酸,其中菌株VC108產吲哚乙酸的能力最強,其次為菌株L2和L25。

表1 供試菌株體外促生能力

2.2 菌株對煙草的促生作用

將菌液對煙草植株進行灌根處理,25 d后對植株的農藝性狀進行拍照和測定(圖2和表2),除菌株L2以外,其他供試菌株處理煙草各項指標的綜合評價均高于對照,其中菌株PS-S和F2促生效果較好,菌株L25和菌株VC48次之。經菌株PS-S菌液處理,煙苗最大葉長和株高顯著提高;經F2菌液處理,煙苗最大葉長和莖直徑顯著提高;L25菌液顯著增加煙苗莖直徑和地上部鮮質量;VC48菌液顯著增加煙株的最大葉寬、最大葉長和莖直徑;W1菌液增加了煙苗最大葉長。

表2 接種供試菌液對煙草農藝性狀的影響

進一步分析供試菌株對煙草根系生長發(fā)育的影響,測定煙草總根長和根投影面積(表3)及根系活力(圖3)。除L2菌液處理外,其他菌液處理煙草總根長均與無菌水對照處理差異顯著(P<0.05);各菌液處理煙草根投影面積均與對照處理差異顯著。除菌株LX7和VC29處理植物根系活力低于對照處理外,其他處理植物根系活力均高于對照處理,尤其是菌株W1和LX5處理顯著提高植物根系活力,說明供試菌株處理對提高煙株根系活力具有促進作用(圖4)。

表3 供試菌株對煙草根系生物量的影響

2.3 熵權法評定促生菌

依據熵權法計算,將前期測得數據整理即得表4,其中X1—X8分別代表煙草最大葉長、最大葉寬、莖直徑、地上部鮮質量、株高、總根長、根投影面積和根系活力。對數據進行標準化處理即隸屬函數值計算,因上述指標均為正向指標,指標數值越大,代表煙草品質越好,故使用正向指標公式得出表5。根據公式,煙草各指標信息熵分別為0.944、0.951、0.978、0.973、0.937、0.933、0.963和0.919。根據煙草各指標信息熵算出煙草各指標的權重分別為0.023、0.021、0.009、0.011、0.026、0.028、0.016和0.034。因此,根系活力的權重為0.034,較其他性狀大,說明在給定樣本數據中,煙草根系活力的數據差異性較大,相對于其他性狀,對評價結果有更大的影響。各促生菌的最終促生效應排名(表6)顯示:排名靠前的菌株有W1、F2、VC48和LX5,說明這4株菌對煙草促生效果顯著。

表4 煙草生物學性狀指標

表5 煙草各指標隸屬函數值

表6 促生菌促生效應綜合排名

3 討論

在農業(yè)中廣泛應用的PGPR一般都兼具多種促生機制,如能夠產生HCN的PGPR,可有效抑制土傳病害[21];具有固氮、溶磷能力的PGPR,在一定程度上可為自身和植物提供可利用氮和磷,促進植物生長[22-23]。Burkholderiasp.7016能促進番茄生長,具有固氮、溶磷、產ACC脫氨酶活性和拮抗土傳病害等功能[22]。PseudomonasaeruginosaPM389能促進狗尾草藜生長,具有拮抗土傳病害、產鐵載體、固氮、溶磷等功能特性[24]。Lin等[25]篩選到21株拮抗真菌病害的芽胞桿菌,同時具有固氮能力和產 IAA 能力,對黃瓜根腐病具有明顯抑制作用,并能促進黃瓜生長。本研究測定25株菌的5項促生指標(固氮能力、產HCN、溶磷能力、解鉀能力、分泌IAA能力),每株PGPR均具有多項促生指標,使用熵權法賦重得到對煙草生物學性狀有顯著提升作用的菌株,如菌株W1、F2、LX5和VC48均具有3項以上促生指標,尤其是菌株W1在固氮能力和解鉀能力表現突出,菌株F2則是在產HCN和解鉀能力表現優(yōu)異。過量的激素可能會抑制植物生長[26]。本研究中,菌株VC108、L2和L25雖然產生生長素相對較多,但是對煙草的促生作用卻不顯著。因此,影響促生菌促進煙草生長的因素是比較復雜的,既有溶磷、解鉀、分泌 IAA能力的影響,也有固氮、吸收營養(yǎng)物質、分泌HCN等因素的影響,以及各個因素間的相互作用[27]。這表明通過接種促生菌株來提高植物的生物量是一個非常有效的途徑,對農業(yè)生產有積極的作用。

煙草生物學性狀是由多個綜合而復雜的因素組成的。單以某一或幾個指標評價某煙草可能優(yōu)于或劣于對照煙草,其片面性難以真實反映煙草性狀特征。同時,各指標既有各自的單方面作用,還有多指標間的相互作用,只有對這些指標的交互作用進行深入研究,才更具客觀與合理性。因此,前人利用不同數據分析或統計方法對多個作物生物學性狀進行綜合評價[10-13]。有關于煙草生物學性狀的分析多集中于其化學成分特性[28],鮮有對煙草生物學特性的綜合評價。本研究利用隸屬函數對計量單位或衡量量化上不同原始數據進行轉化,使各指標都具有一定的統計學意義與生物學意義,結果表明影響煙草生物學性狀綜合評價的關鍵因子從大到小依次為:根系活力、總根長、株高、煙草最大葉長、最大葉寬、根投影面積和、地上部分鮮質量、莖直徑,即根系活力對綜合評價煙草生物學性狀影響大。相對而言,莖直徑等指標貢獻性較小,這為煙草生物學性狀綜合評價提供新的方法。

本研究采用熵權法對煙草促生效果進行綜合評價,與其他評價方法相比,該方法可以避免根據傳統經驗評價的主觀性、標準的單一性,能夠給出有較大區(qū)分度的、直觀的評價結果。本研究篩選的PGPR是在室內純培養(yǎng)的條件下進行,促生試驗是在培養(yǎng)箱可控條件下開展的,而在自然條件下影響菌株的促生效果的因素有很多,例如:土壤、原著微生物、氣候和植物自身因素等[29]。因此,篩選菌株是否能用于微生物肥料生產,還需要進一步的田間驗證。

研究結果表明,W1具有較強的固氮和解鉀能力,F2具有較強的產HCN、解鉀和產生長素的能力,VC48和LX5具有較強的產HCN和生長素的能力,4株菌均具有2種及2種以上促生特性。根據盆栽試驗,這4株菌也能較好促進煙草生長的提升,說明這4個菌株具有較強的植物促生能力,可以作為研發(fā)煙草專用生物有機肥菌種,但不同PGPR菌株促生效果存在差異,田塊差異、土壤差異可能是產生影響的因素之一,需進一步觀察這些菌株在田間栽培效果。綜上所述,菌株W1、F2、VC48和LX5可以作為煙草促生有機肥的功能菌株,具有較好的應用潛力。