徐蘇微,邢通,李蛟龍,張林,高峰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/江蘇省動物源食品生產(chǎn)與安全保障重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210095)

近年來,禽肉因其相對低廉的價格以及豐富的營養(yǎng)價值深受消費(fèi)者喜愛[1]。隨著生活水平的提高,消費(fèi)者越來越重視禽肉品質(zhì)。因此,國內(nèi)外禽肉生產(chǎn)者以及科研人員致力于尋找有效的方法來提高禽肉品質(zhì),以滿足消費(fèi)者的需求。肌纖維是組成肌肉的基本單位,不同類型的肌纖維具有不同的肌球蛋白 ATPase 活性、糖原含量以及糖酵解潛力(glycolytic potential,GP),并對宰后肌肉的pH值、肉色、系水力、嫩度等肉品質(zhì)指標(biāo)有較大影響[2-3]。畜禽肌纖維數(shù)目通常在出生前已經(jīng)確定,但肌纖維類型會受生長環(huán)境、運(yùn)動和營養(yǎng)等因素的影響而改變[4],進(jìn)而影響肉品質(zhì)。鈣調(diào)磷酸酶-活化T細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(calcineurin-nuclear factor of activated T cells,CaN-NFAT)是一條調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化的重要信號通路,肌漿網(wǎng)中鈣離子濃度持續(xù)升高,可上調(diào)CaNmRNA的表達(dá),進(jìn)而激活該通路,促進(jìn)Ⅱ型肌纖維向Ⅰ型肌纖維轉(zhuǎn)化[4]。

?；撬崾且环Nβ-含硫氨基酸,廣泛分布于動物的組織和器官[5]。研究發(fā)現(xiàn),?；撬峋哂姓{(diào)節(jié)鈣離子濃度、維持滲透壓平衡、提高機(jī)體抗氧化能力等生物學(xué)功能[6]。因此,?；撬嵋驯粡V泛應(yīng)用于臨床、制藥、食品、畜牧等領(lǐng)域。在畜牧生產(chǎn)上,有研究表明?；撬峥梢宰鳛轱暳咸砑觿﹣砀纳萍∪馄焚|(zhì),但關(guān)于其改善的機(jī)制尚不清楚。因此,本試驗(yàn)以愛拔益加(Arbor Acres,AA)肉雞為試驗(yàn)對象,研究在日糧中添加?；撬釋ζ淙馄焚|(zhì)、宰后糖酵解潛力及肌纖維特性的影響,并進(jìn)一步探究?；撬嵊绊戨u肉品質(zhì)的潛在機(jī)制,以期為?；撬嵩谛笄萆a(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

?；撬?純度>99.9%,購于諾奧(美國)公司;AA肉雞,28日齡,健康且體質(zhì)量相近,購于正大食品(宿遷)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)采取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),選取72只28日齡雄性AA肉雞,隨機(jī)分為2組,每組設(shè)6個重復(fù),每個重復(fù)6只雞。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,處理組在基礎(chǔ)日糧中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的?；撬?試驗(yàn)期為14 d。基礎(chǔ)日糧為玉米-豆粕型日糧,日糧設(shè)計(jì)參照美國國家研究委員會(NRC)1994標(biāo)準(zhǔn)配制。日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期內(nèi)自由采食、飲水。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 樣品采集

在試驗(yàn)期的第14天,分別從每個重復(fù)中隨機(jī)選取2只雞進(jìn)行空腹稱體質(zhì)量,頸動脈放血宰殺,待肉雞死亡后立即解剖取樣。剝離整個右側(cè)腿肌,稱質(zhì)量后置于4 ℃冷藏,用于肉品質(zhì)指標(biāo)的測定。在肉雞左腿束狀脛骨前肌沿肌纖維走向取1.5 cm×1 cm×1 cm的樣品,放入體積分?jǐn)?shù)為4%甲醛固定液中,并置于4 ℃條件下保存以備肌纖維直徑和密度的測定。采集肉雞左側(cè)腿肌樣品于凍存管中,加入液氮,隨后置-80 ℃保存待測。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 糖酵解潛力參照南京建成生物科技研究所試劑盒說明書測定腿肌中糖原、乳酸含量(μmol·g-1),再參考Wang等[7]的方法計(jì)算糖酵解潛力(GP,μmol·g-1):GP=2×糖原含量+乳酸含量。

1.4.2 肉品質(zhì)pH值參考Brambila等[8]的方法,在宰后45 min和24 h,使用HI9125便攜式pH計(jì)探頭以45°斜插入腿肌中,分別測定腿肌的pH45 min和pH24 h值。每個樣品在不同位置測定3次,取平均值。

肉色:參考Niu等[9]的方法,在宰后24 h,使用CR410色差儀測定腿肌亮度值(lightness,L*)、紅度值(redness,a*)和黃度值(yellowness,b*)。每個樣品在不同位置測定3次,取平均值。

滴水損失:參考Li等[10]的方法,在宰后24 h,從右側(cè)腿肌順著肌纖維方向切取大小為4 cm×3 cm×2 cm 的樣品,稱質(zhì)量并記錄(始質(zhì)量),放入裝滿氮?dú)獾淖苑獯?在4 ℃冷庫中懸掛24 h后取出,用吸水紙吸干表面水分,稱質(zhì)量并記錄(末質(zhì)量)。滴水損失=(始質(zhì)量-末質(zhì)量)/始質(zhì)量×100%。

蒸煮損失:參考Li等[10]的方法,在宰后48 h,將測過滴水損失的肉樣質(zhì)量記為始質(zhì)量,放入自封袋中并置于75 ℃的水浴鍋中蒸煮,直至肉樣中心溫度達(dá)到70 ℃,之后肉樣用流水冷卻至室溫,用吸水紙吸干表面水分,稱質(zhì)量并記錄(末質(zhì)量)。蒸煮損失=(始質(zhì)量-末質(zhì)量)/始質(zhì)量×100%。

剪切力:參考Gao等[11]的方法,將測過蒸煮損失的肉樣順著肌纖維方向切成2個大小為3 cm×1 cm×1 cm 的肉條,用C-LM3B數(shù)顯式肌肉嫩度儀沿肌纖維垂直方向測定剪切力(N)。每個肉條測定3次,取平均值。

1.4.3 肌纖維特性肌纖維直徑、密度:參考郭照宙等[12]的方法,取出固定于多聚甲醛中的腿肌樣品,用石蠟包埋后,用切片機(jī)切成厚度為6 μm的切片。貼片并用濾紙吸去多余水分,干燥后置于4 ℃保存。將制備好的切片脫蠟,再進(jìn)行蘇木素-伊紅染色。使用BX50型光學(xué)顯微鏡在10×20倍視野下拍照,每張切片隨機(jī)選取5個視野,并用Image-Pro Plus軟件測定腿肌肌纖維直徑(μm)和密度(N·mm-2)。

肌纖維類型:參考Liu等[13]的方法,提取腿肌蛋白,并將蛋白濃度調(diào)節(jié)至0.128 mg·mL-1。制備體積分?jǐn)?shù)為4%的濃縮膠和6%的分離膠,在每條電泳膠上加2 μg總蛋白,4 ℃循環(huán)水浴,125 V電泳66 h。電泳結(jié)束后,使用考馬斯亮藍(lán)R-250對蛋白染色2 h,脫色3次,每次3 h,至呈現(xiàn)干凈的凝膠背景。用GT-800 F掃描儀對蛋白拍照,并用Image J軟件計(jì)算不同肌纖維類型所占比例。

1.4.4 CaN-NFAT信號通路關(guān)鍵基因采用Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA,用超微量分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度。RNA濃度以500 ng·μL-1為宜;純度采用A260/A280值來衡量,比值在1.8～2.0為宜。

參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,將符合濃度和純度條件的RNA反轉(zhuǎn)錄為cNDA。儀器參數(shù)設(shè)置為37 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃至結(jié)束。

從GenBank中獲取所有基因參考序列,設(shè)計(jì)引物并由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列表見表2。

表2 熒光定量PCR引物序列

參考SYBRPremixExTaq說明書加樣,反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃、30 s;95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40個循環(huán);95 ℃、15 s,60 ℃、1 min,95 ℃、15 s。每個基因樣品3個重復(fù),計(jì)算3次CT值的平均值,用2-ΔΔCT法[14]分析相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；撬釋θ怆u腿肌肉品質(zhì)的影響

由表3可見:與對照組相比,?；撬峤M肉雞腿肌pH45 min值顯著提高(P<0.05),pH24 h值極顯著提高(P<0.01),蒸煮損失顯著降低(P<0.05),剪切力極顯著降低(P<0.01),但L*、a*、b*值和滴水損失無顯著變化(P>0.05)。

表3 牛磺酸對肉雞腿肌肉品質(zhì)的影響

2.2 ?；撬釋θ怆u糖酵解潛力的影響

由表4可見:日糧中添加?；撬犸@著降低腿肌中乳酸含量(P<0.05),極顯著降低GP(P<0.01),但對糖原含量無顯著影響(P>0.05)。

表4 ?；撬釋θ怆u腿肌糖酵解潛力(GP)的影響

2.3 ?；撬釋θ怆u肌纖維直徑和密度的影響

由表5和圖1可見:日糧中添加?；撬針O顯著降低腿肌肌纖維的直徑(P<0.01),極顯著提高肌纖維的密度(P<0.01)。

表5 ?；撬釋θ怆u腿肌肌纖維直徑和密度的影響

2.4 牛磺酸對肉雞肌纖維類型的影響

由圖2可見:與對照組相比,?；撬峤M肉雞腿肌Ⅰ型肌纖維所占比例顯著提高(P<0.05),Ⅱb型肌纖維所占比例顯著降低(P<0.05),而Ⅱa型肌纖維所占比例無顯著變化(P>0.05)。

2.5 牛磺酸對CaN-NFAT信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖3可見:日糧中添加?；撬犸@著提高了肉雞腿肌中CaN、NFATc1、MEF2C和PGC1αmRNA的表達(dá)水平(P<0.05),但對CaM、MyoD和Myf5mRNA的表達(dá)水平無顯著影響(P>0.05)。

3 討論

pH值、肉色、系水力和嫩度等是評價肉品質(zhì)的常用指標(biāo)。pH值對肉色、嫩度、保水性和肉的貯藏期都有直接影響。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn),在日糧中添加0.5%?；撬峥娠@著提高慢性熱應(yīng)激肉雞胸肌的pH45 min值。在本試驗(yàn)中,日糧中添加0.5%?；撬峥娠@著提高肉雞pH45 min和pH24 h值。宰后糖酵解代謝速率直接影響pH的下降程度和速率,而糖酵解速率與肌纖維類型密切相關(guān)。Ⅱb型肌纖維中ATP酶活性、糖原含量以及糖酵解潛力均高于其他類型肌纖維[16]。在本試驗(yàn)中,?；撬岬奶砑语@著減少了肉雞腿肌中Ⅱb型肌纖維的比例,并降低糖酵解潛力,而對糖原含量無顯著影響。這表明牛磺酸可能通過調(diào)控腿肌肌纖維的轉(zhuǎn)化,降低宰后糖酵解速率,減少糖原的分解,進(jìn)而降低乳酸的產(chǎn)生。這也解釋了本試驗(yàn)中牛磺酸組肉雞腿肌pH值升高的原因。Jeong等[17]研究指出,Ⅰ型肌纖維屬于慢速氧化型纖維,血紅蛋白含量較高,肉色較紅。然而在本試驗(yàn)中,雖然?；撬岬奶砑语@著增加了Ⅰ型肌纖維的占比,卻對肉色沒有顯著影響。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的確切原因還不清楚,因?yàn)榧〖t蛋白化學(xué)狀態(tài)、脂肪氧化狀態(tài)和線粒體活性等因素都影響肉色[18]。在本試驗(yàn)中,?；撬岬奶砑语@著降低了肉雞腿肌的蒸煮損失,這與曾得壽等[19]的研究結(jié)果一致,其原因可能是牛磺酸的添加延緩了宰后pH值的下降,蛋白質(zhì)變性程度降低,進(jìn)而提高肉雞腿肌的系水力。肌纖維的直徑、類型、肌內(nèi)脂肪含量等因素對肌肉的嫩度有重要的影響。Ⅰ型肌纖維直徑較細(xì),密度較大,嫩度較高,而Ⅱb型肌纖維直徑較粗,密度較小,嫩度較差[16]。臧素敏等[20]研究指出在日糧中添加0.1%～0.15%牛磺酸可顯著降低肉鴨胸肌的剪切力和肌纖維直徑,增加肌纖維密度。在本試驗(yàn)中,與對照組相比,牛磺酸組肉雞腿肌的剪切力顯著降低,這可能與?；撬岬奶砑咏档腿怆u腿肌肌纖維的直徑,同時增加肌纖維的密度有關(guān)。

CaN-NFAT信號通路在調(diào)節(jié)骨骼肌肌纖維類型的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。CaN是一種依賴于Ca2+/CaM的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。NFAT是CaN的一個關(guān)鍵底物,以磷酸化的形式存在于細(xì)胞液中。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加時,Ca2+便與CaM結(jié)合并激活CaN,從而使NFAT去磷酸化,從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),并與靶基因結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)慢肌纖維基因的表達(dá)[4]。MEF2C是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MADS-box家族中的成員,在維持肌纖維比例和肌細(xì)胞成熟中發(fā)揮重要功能。PGC1α是核轉(zhuǎn)錄的一種輔助激活因子,能協(xié)同NFAT和MEF2C調(diào)節(jié)Myf5、肌球蛋白重鏈、肌紅蛋白等多種肌肉特異性基因的表達(dá)[21]。Dutka等[22]研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸的添加可提高人肌肉肌漿網(wǎng)中Ca2+濃度。在本試驗(yàn)中,?；撬峤MCaN、NFATc1、MEF2C和PGC1αmRNA的表達(dá)水平顯著升高。這一結(jié)果的產(chǎn)生可能是因?yàn)榕；撬釋a2+的調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)CaNmRNA的表達(dá),進(jìn)而激活CaN-NFAT信號通路。Cong等[23]發(fā)現(xiàn)肉雞腿肌中CaNmRNA表達(dá)水平的增加與Ⅰ型肌纖維比例提高以及Ⅱb型肌纖維比例降低顯著相關(guān)。因此本試驗(yàn)牛磺酸組肉雞腿?、裥图±w維占比的顯著提高和Ⅱb型肌纖維占比的顯著降低可能是因?yàn)榕；撬岬奶砑蛹せ盍薈aN-NFAT信號通路。

綜上所述,日糧中添加牛磺酸可通過激活CaN-NFAT信號通路,促進(jìn)腿肌肌纖維由Ⅱb型向Ⅰ型轉(zhuǎn)化,降低糖酵解潛力(GP),改善肉雞腿肌肉品質(zhì)。