郭迎樹
(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病介入科,鄭州 450000)
缺血性腦卒中(cerebral arterial thrombosis)是由于腦動脈狹窄或堵塞、腦組織供血不足而引起的腦組織壞死的疾病總稱,包括短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack,TIA)、可逆性缺血性神經(jīng)功能缺失(reversible ischemic neurologicdeficit,RIND)、進展性腦卒中(progressive stroke,PS)、完全性腦卒中(complete stroke,CS)[1-2]。缺血性腦卒中后可因腦組織缺血缺氧,無法供給能量,使鈉離子大量內(nèi)流,細(xì)胞膜出現(xiàn)過度去極化,導(dǎo)致腦部癲性放電,引起癲癇發(fā)作[3-4]。癲癇(epilepsy,EP)是以腦部神經(jīng)元異常放電而引起反復(fù)癇性發(fā)作的慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征。癲癇的長期發(fā)作可導(dǎo)致腦部物質(zhì)發(fā)生改變,易引起腦水腫及腦部神經(jīng)細(xì)胞的損害,甚至是神經(jīng)細(xì)胞的死亡[5]。本研究旨在探討天麻素注射液對大鼠缺血性腦卒中后癲癇發(fā)作及神經(jīng)保護作用的影響,為臨床提供參考。
60只健康成年雄性SD大鼠[合格證號:SCXK(滬)20130016]:南京君科生物工程有限公司,SPF級,貨號J001,體重(320.43±21.36) g,自由飲食、飲水和活動。
氯化鋰(美國Amresco公司,貨號0416,規(guī)格:5 g);匹羅卡品(美國Sigma公司,貨號P650,規(guī)格:1G);地西泮注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H12020957,規(guī)格:2 ml*10 mg);天麻素注射液(昆藥集團股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H20013046,規(guī)格:2 ml*6支);0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H20056626,規(guī)格:100 ml);水合氯醛溶液(青島宇龍海藻有限公司,國藥準(zhǔn)字H37022673,規(guī)格:500 g);4%多聚甲醛溶液(北京索萊寶科技有限公司,貨號P1110,規(guī)格:100 ml);磷酸緩沖鹽溶液(武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號PB180327,規(guī)格:500 ml);OCT包埋劑(美國Lycra公司,貨號4853,規(guī)格:118 ml);牛血清白蛋白(BSA,北京索萊寶科技有限公司,貨號A8010,規(guī)格:5 g);2×蛋白上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,貨號P1018,規(guī)格:10 ml);1×TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,貨號T1085,規(guī)格:500 ml);1×PBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,貨號P1031,規(guī)格:500 ml);過氧化氫溶液(廣東恒建制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H44023919,規(guī)格:100 ml);超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品編號P0018,規(guī)格:500 ml);BCA蛋白含量測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品編號P0012S,規(guī)格:200次);兔抗半胱氨酸蛋白酶-3 (cysteine proteinase-3,Caspase-3)多克隆抗體(北京百奧萊博科技有限公司,貨號YT691-QRP);小鼠抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)單克隆抗體(LSBio公司,貨號LS-C204627);兔抗p38多克隆抗體(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,貨號C1811);小超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號PV-9002,規(guī)格:3 ml);辣根過氧化酶(horseradish,HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(美國Abbkine公司,貨號A21020);HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(美國Abbkine公司,貨號A21010);增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司,貨號PA110);Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品編號A0516);Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品編號A0521);異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品編號A0562);FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品編號A0568);兔抗神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron specific nucleoprotein,NeuN)IgG(英國Abcam公司,貨號ab177487);小鼠抗NeuN IgG(英國Abcam公司,貨號ab104224);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)染色液(美國Sigma公司,貨號D9542,規(guī)格:5 mg)。
96孔板(美國Corning公司,貨號2499);垂直電泳系統(tǒng)(英國Cleaver公司,型號OmniPAGE Maxi);冰凍切片機(德國Leica公司,型號CM3050S);勻漿機(瑞士Kinematica公司,型號PT2500E);酶標(biāo)儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司,型號PT-3502G)。
按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、缺血性腦卒中后癲癇發(fā)作組(模型組)、低劑量組、中劑量組及高劑量組,每組大鼠均為12只,分別編號1~12號。低劑量組給予60 mg/kg天麻素注射液預(yù)處理、中劑量組給予90 mg/kg天麻素注射液預(yù)處理、高劑量組給予120 mg/kg天麻素注射液預(yù)處理,對照組與模型組給予相同劑量的0.9%氯化鈉注射液。除對照組外,其余4組給予127 mg/kg氯化鋰腹腔注射,18 h后給予30 mg/kg匹羅卡品腹腔注射,對照組給予相同劑量的0.9%氯化鈉注射液,此期間嚴(yán)密觀察小鼠癲癇發(fā)作情況,正常飲食,常規(guī)護理,于癲癇發(fā)作后2 h給予地西泮注射液終止發(fā)作,于癲癇發(fā)作3 h后取材。
大鼠癲癇發(fā)作評價標(biāo)準(zhǔn)(Racine分級)[6]:① 0級:無任何反應(yīng)。② Ⅰ級:面部陣攣,出現(xiàn)眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼、濕狗樣抖動等表現(xiàn)。③ Ⅱ級:Ⅰ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)節(jié)律性點頭和(或)甩頭。④ Ⅲ級:Ⅱ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢陣攣。⑤ Ⅳ級:Ⅲ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)后肢站立。⑥ Ⅴ級:Ⅳ級基礎(chǔ)上出現(xiàn)雙側(cè)前后肢強直、身體背屈強直、跌倒、持續(xù)站立和傾倒、失去平衡、四肢抽動。
癲癇發(fā)作后3 h,10%水合氯醛0.3 g/kg腹腔注射進行麻醉,每組1~6號大鼠給予0.9%氯化鈉注射液心臟灌注,直至流出液為澄清液體,快速將大鼠頭部切斷,取出腦組織,分離大鼠的大腦皮質(zhì),勻漿后放置于80 ℃的超低溫冰箱中備用,進行免疫印跡試驗(Western Blot)。每組7~12號大鼠給予0.9%氯化鈉注射液心臟灌注,直至流出液為澄清液體;再用4%多聚甲醛200 ml灌注固定,快速將大鼠頭部切斷;取出腦組織,將腦組織置于含4%多聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)中保存24 h,然后分別在30%、20%、10%蔗糖脫水;腦組織下沉后,置于OCT包埋劑固定,取 15 μm 厚的大腦皮質(zhì)部位冠狀冰凍切片,貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理后的載玻片上,置于20 ℃的冰箱中備用,進行免疫組化染色及免疫熒光染色。
將BCA蛋白含量測定試劑盒中的試劑A與試劑B按50∶1的比例混合均勻,至液體顏色變?yōu)槟劬G色。用BSA分別配制0、62.5、125、250、500、1000、2000 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白,并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。96孔板中每孔均加入200 μl工作液,待測樣品20 μl,每孔液體振蕩并混合均勻,置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。利用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度(A562nm),根據(jù)軟件計算樣品的濃度值及上樣量。
將2×蛋白上樣緩沖液加入樣品中,煮沸 5 min,然后按照每孔100 μg的蛋白量上樣。將標(biāo)本置于12%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳,濃縮膠電壓為74 V,分離膠電壓為100 V,當(dāng)標(biāo)記物接近膠底板時停止電泳。轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,恒流轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂牛奶進行封閉,室溫下置于搖床上搖晃2 h后,按照 1∶1000 的比例加入小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗Caspase-3多克隆抗體和兔抗p38多克隆抗體,4 ℃過夜;次日用1×TBST緩沖液漂洗3次,每次 10 min,按照1∶2000的比例加入相應(yīng)HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L),室溫下置于搖床中輕搖孵育1 h;用1×TBST緩沖液漂洗4次,每次15 min,加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑,室溫下反應(yīng)3 min,進行暗室曝光、顯影和定影,并掃描條帶,運用Image J軟件進行分析。
將2×蛋白上樣緩沖液加入樣品中,煮沸 5 min,然后按照每孔100 μg的蛋白量上樣。將標(biāo)本置于12%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳,濃縮膠電壓為74 V,分離膠電壓為100 V,當(dāng)標(biāo)記物接近膠底板時停止電泳。轉(zhuǎn)印至PVDF膜,恒流轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂牛奶進行封閉,室溫下置于搖床上搖晃2 h后,按照1∶1000的比例加入兔抗p38多克隆抗體,4 ℃過夜;次日用1×TBST緩沖液漂洗3次,每次 10 min,按照1∶2000的比例加入相應(yīng)HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L),室溫下置于搖床中輕搖孵育1 h;用1×TBST緩沖液漂洗4次,每次15 min,加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑,室溫下反應(yīng)3 min,進行暗室曝光、顯影和定影,并掃描條帶,運用Image J軟件進行分析。
每組隨機抽取一張切片,在PBS溶液中漂洗3次,每次10 min,然后加入0.3%過氧化氫溶液反應(yīng)10 min,以殺滅內(nèi)源性過氧化物酶的活性;用1×PBST緩沖液漂洗3次,每次5 min,用10%山羊血清室溫下封閉2 h;甩去多余液體,按照1∶1000加入小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體和兔抗Caspase-3多克隆抗體,4 ℃過夜;次日復(fù)溫30 min后,用1×PBST緩沖液漂洗3次,每次10 min,加入相應(yīng)HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L),并用小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑盒進行檢測,陰性對照用PBS溶液代替一抗;顯微鏡下控制DAB顯色,放入蒸餾水中終止反應(yīng),分別用85%、95%、100%的酒精梯度脫水,以二甲苯脫脂和透明,中性樹膠封片;在同一條件,利用顯微鏡觀察并拍片,結(jié)果運用Image prupro 6.0圖像分析系統(tǒng)進行分析;陽性細(xì)胞數(shù)取3個值的平均值。
每組隨機抽取一張切片,在PBS溶液中漂洗4次,每次10 min,然后用10%山羊血清室溫下封閉 2 h;按照1∶1000的比例加入小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體與兔抗NeuN IgG、兔抗Caspase-3多克隆抗體與小鼠抗NeuN IgG孵育2 h;用1×PBST緩沖液漂洗4次,每次10 min,按照1∶2000的比例加入相應(yīng)的Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)與FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)與FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)孵育2 h;用 1×PBST緩沖液漂洗4次,每次10 min,加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑,室溫下反應(yīng)5 min,再用1×PBST緩沖液漂洗3次,每次5 min;在同一條件,利用顯微鏡觀察并拍片,結(jié)果運用Image prupro 6.0圖像分析系統(tǒng)進行分析。陽性細(xì)胞數(shù)取3個值的平均值。
采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用配對t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗;有序分類變量資料采用秩和檢驗。P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
對照組無癲癇發(fā)作;腹腔注射匹羅卡品后,模型組大鼠5 min后出現(xiàn)淚腺分泌增加、骨骼肌收縮等膽堿能興奮反應(yīng),且低劑量組發(fā)作潛伏期[(28.64±4.75) min]、中劑量組發(fā)作潛伏期[(32.25±5.21) min]及高劑量組發(fā)作潛伏期[(29.36±4.52) min]具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
癲癇發(fā)作72 h后,模型組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2含量高于對照組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2含量高于模型組,Caspase-3含量低于模型組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見圖1。
A:對照組;B:模型組;C:低劑量組;D:中劑量組;E:高劑量組圖1 大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2與Caspase-3含量
低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2陽性神經(jīng)元數(shù)量高于模型組,且中劑量組高于低劑量組、高劑量組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Caspase-3陽性神經(jīng)元數(shù)量低于模型組,且中劑量組低于低劑量組、高劑量組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。
表1 大鼠大腦皮層中Bcl-2與Caspase-3陽性神經(jīng)元數(shù)量 個/mm2
低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2表達高于模型組,且中劑量組高于低劑量組、高劑量組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Caspase-3表達低于模型組,且中劑量組低于低劑量組、高劑量組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表2。
表2 大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2與Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù) 個/mm2
模型組大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性高于對照組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性低于模型組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見圖2。
A:對照組;B:模型組;C:低劑量組;D:中劑量組;E:高劑量組圖2 大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性變化
缺血性腦卒中是臨床上常見的腦外科疾病,隨著人口老齡化的進展,缺血性腦卒中的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[7]。癲癇病因較為復(fù)雜,主要分為三類,包括特發(fā)性癲癇、癥狀性癲癇和隱源性癲癇[8-9]。有研究表明[10],缺血性腦卒中后癲癇發(fā)作存在兩個高峰期,即缺血性腦卒中后24 h和梗死后6個月~1年內(nèi)。目前,癲癇主要以藥物治療為主。有研究表明[11],仍有10%~15%的患者對藥物治療不敏感,需要進行外科治療。
天麻屬多年生草本植物,根莖入藥可治療頭暈、肢體麻木及小兒驚厥等,與靈芝合用可治療頭痛、失眠。天麻素為天麻的有效成分,具有較高的藥用價值[12-13]。p38蛋白激酶屬應(yīng)激激活的蛋白激酶,主要存在于腺體組織。與體內(nèi)凋亡啟動、細(xì)胞周期靜止有密切關(guān)系,p38蛋白激酶對于不同腫瘤細(xì)胞作用不同[14]。有研究表明[15],天麻素通過下調(diào)大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性,減輕由興奮性氨基酸(excitatory amino acids,EAA)對神經(jīng)系統(tǒng)引起的興奮性毒性作用。本研究表明,模型組大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性高于對照組;低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中p38活性低于模型組,說明天麻素對p38蛋白激酶具有調(diào)控作用,使大鼠體內(nèi)p38水平下調(diào)。
Bcl-2是一種原癌基因,可抑制由多種細(xì)胞毒因素引起的細(xì)胞死亡。體內(nèi)Bcl-2的過度表達可增強細(xì)胞對細(xì)胞毒素的抵抗力。Caspase-3是一種蛋白酶,為細(xì)胞凋亡中主要的終末剪切酶,并且為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)殺傷機制的重要組成部分[16]。Caspase-3底物中最重要的底物為多聚ADP-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose Polymerase,PARP)。PARP與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)(zinc finger)與羧基端的催化區(qū)域分離,使體內(nèi)鈣/鎂依賴性核酸內(nèi)切酶(endonuclease)活性增高,裂解核小體(nucleosome)間的DNA,引起細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示,低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2陽性神經(jīng)元數(shù)量高于模型組,且中劑量組高于低劑量組、高劑量組;低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Caspase-3陽性神經(jīng)元數(shù)量低于模型組,且中劑量組低于低劑量組、高劑量組;低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2表達高于模型組,且中劑量組高于低劑量組、高劑量組;低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中Caspase-3表達低于模型組,且中劑量組低于低劑量組、高劑量組,說明天麻素可增加癲癇發(fā)作大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2蛋白表達,并降低Caspase-3蛋白表達,抑制體內(nèi)癲癇凋亡的發(fā)生,具有保護大腦的作用。
綜上,天麻素注射液可抑制缺血性腦卒中癲癇發(fā)作大鼠大腦皮質(zhì)中促凋亡因子水平,增加抗凋亡因子水平,且可降低體內(nèi)p38蛋白激酶水平,具有保護腦部神經(jīng)作用,安全性較好,具有臨床參考價值。