陳 艷，牛三強(qiáng)，胡衛(wèi)平，錢莉莉

宮頸癌(cervical cancer，CC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，全球每年估計(jì)有50萬例新病例，其中有30萬人死亡[1]。近年來，相關(guān)報(bào)道表明， CC的發(fā)病正在向年輕化方向發(fā)展。CC與高危HPV感染有關(guān)。研究[2-3]表明，單一的高危HPV感染不足以引起CC，遺傳因素和免疫因素在CC的發(fā)展中也起著重要作用。在過去的幾十年中，對(duì)癌癥表觀遺傳修飾，特別是DNA甲基化及其對(duì)腫瘤致癌作用的研究一直在不斷增加[4]；然而，表觀遺傳因素對(duì)CC的影響仍然未知，DNA甲基化經(jīng)常發(fā)生在多種癌癥中，例如結(jié)腸癌、乳腺癌和CC[5-7]。盡管認(rèn)為生長抑制因子4 (growth inhibitory factor 4，ING4)啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化是ING4產(chǎn)生的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，但尚未在CC中研究此類事件。因此，該研究的目的是評(píng)估CC組織中ING4啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況與CC發(fā)生的臨床意義，并為研究CC的發(fā)生和發(fā)展提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集安徽省立醫(yī)院2018年1月～2019年10月確診的80例CC患者組織標(biāo)本(CC組)，并以同期在該院治療的子宮良性病變行子宮全切患者的50例標(biāo)本作為對(duì)照組。以上患者均無術(shù)前治療及放化療。所有患者均經(jīng)病理證實(shí)。標(biāo)本收集后保存在-80 ℃直至分析使用。所有患者在收集樣品前均已獲得知情同意。該協(xié)議由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腫瘤的組織學(xué)類型和等級(jí)進(jìn)行分類。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)確定每種癌癥的分期。

1.2 方法

1.2.1組織DNA提取和亞硫酸氫鹽處理 按照組織DNA 提取試劑盒步驟獲取組織標(biāo)本中DNA，并用分光光度儀測(cè)定核酸濃度，通過亞硫酸氫鹽處理，DNA的未甲基化胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持未修飾。使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit)對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行修飾。修飾的DNA保存在-80 ℃存儲(chǔ)以備后用。

1.2.2甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MSP) MSP是使用甲基化或未甲基化DNA的特異性引物對(duì)經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到DNA是否甲基化的信息。通過MSP方法分析所有樣品。同時(shí)使用UCSC網(wǎng)站獲取ING4基因上游啟動(dòng)子序列約1 000 bp，Methprimer進(jìn)行MSP引物的設(shè)計(jì)見圖1，引物序列、退火溫度和預(yù)期的產(chǎn)物大小見表1。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在總體積為20 μl，模板2 μl(200 ng)，10× PCR buffer 2 μl，Mg2+1.6 μl，dNTP mix 0.4 μl，DMSO 0.4 μl，MSP上下游引物(10 pmol/μl,2 μl),HS-Taq酶0.2 μl，滅菌雙蒸水11.4 μl。PCR條件為95 ℃預(yù)變性5 min，開始循環(huán)，95 ℃變性20 s，使用各引物退火溫度退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次，最后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)在PCR儀(G-Storm GSI PCR擴(kuò)增儀)中進(jìn)行。使用經(jīng)過SssI甲基化酶(北京NEB公司)處理后的人外周血DNA作為甲基化陽性DNA對(duì)照，該酶甲基化了DNA中CpG二核苷酸的每個(gè)胞嘧啶。每個(gè)試驗(yàn)都包括水空白。PCR產(chǎn)物在溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠上可視化。僅將未甲基化引物的陽性擴(kuò)增解釋為未甲基化。將甲基化引物或甲基化和未甲基化引物的正擴(kuò)增視為甲基化。

1.2.3RNA提取和實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 根據(jù)制造商的說明使用TRIzol(上海玉博生物科技有限公司)提取總RNA。 使用GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(北京Promega生物技術(shù)有限公司)從5 μg總RNA中制備cDNA。使用PCR試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)從5 μg cDNA中擴(kuò)增ING4基因。 循環(huán)條件為在94 ℃下預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行45輪循環(huán)(94 ℃下變性30 s，在57 ℃下進(jìn)行20 s退火，并在72 ℃下延伸30 s)最后的延伸步驟在72 ℃下進(jìn)行10 min，并將產(chǎn)品存儲(chǔ)在4 ℃下。ING4引物序列為5′-CACAAGTCCTG AGTATGGGAT-3′(正向)和5′-AGGGATGTGGAAGA AACTGT-3′(反向)，預(yù)期大小為295 bp。 GAPDH引物序列為5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTG-3′(正向)和5′-CTGTTGTCGGAGTTCTAGTAG-3′(反向)，預(yù)期大小為385 bp。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)，并用內(nèi)源性GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)數(shù)據(jù)。所有實(shí)時(shí)PCR重復(fù)3次。

表1 ING4基因MSP引物序列

2 結(jié)果

2.1 CC組和對(duì)照組臨床病理特征80例CC患者和50例對(duì)照組的臨床病理特征見表2。根據(jù)現(xiàn)有的留存病理報(bào)告，CC組與對(duì)照組在年齡、初潮年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、妊娠次數(shù)、分娩次數(shù)、癌癥家族史等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 ING4的異常啟動(dòng)子甲基化ING4基因的MSP反應(yīng)的代表性譜帶見圖2。在CC組中，ING4啟動(dòng)子甲基化率為82.5%(66/80)，在對(duì)照組中12.0%(6/50)，CC組中ING4基因啟動(dòng)子的甲基化率高于對(duì)照組(P<0.001)。

2.3 CC組和對(duì)照組患者組織標(biāo)本中ING4基因表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，CC組中ING4 mRNA表達(dá)(0.41±0.07)低于對(duì)照組中 ING4 mRNA表達(dá)(0.87±0.16)(t=22.53，P<0.01)。此外，ING4啟動(dòng)子區(qū)甲基化的CC患者組織中ING4 mRNA水平平(0.37±0.06,n=66)低于ING4啟動(dòng)子區(qū)未甲基化CC患者組織中的ING4 mRNA水平(0.46±0.11,n=14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.318，P<0.01)。

圖1 ING4基因的MSP引物設(shè)計(jì)示意圖

表2 CC組和對(duì)照組的部分臨床特征

圖2 ING4基因啟動(dòng)子區(qū)部分MSP結(jié)果

2.4 ING4高甲基化與CC臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)甲基化狀態(tài)，對(duì)CC組織中ING4啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行多變量分析，結(jié)果見表3。ING4啟動(dòng)子區(qū)的甲基化與以下臨床病理特征之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：包括年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管侵犯、切緣侵犯、FIGO分期、組織學(xué)分型、腫瘤大小和HPV感染(P>0.05)。

3 討論

CC是全球女性中第三大最常被診斷的癌癥，也是第四大導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因，并且目前仍然是主要的公共衛(wèi)生問題[8]。CC的發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟的癌變過程，涉及復(fù)雜的遺傳和表觀遺傳機(jī)制。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種常見形式，而通過其啟動(dòng)子(尤其是CpG島)的超甲基化而沉默，與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[5,9]。 Paz et al[9]報(bào)道在所分析的70個(gè)腫瘤細(xì)胞系中，至少每個(gè)都存在一個(gè)高甲基化基因。 此外，研究表明腫瘤中的癌癥干細(xì)胞基因由于甲基化而被下調(diào)，例如在膀胱癌[10]、大腸癌[5]和CC[11]。 因此，基因甲基化狀態(tài)的改變是參與致癌的關(guān)鍵因素之一。

表3 ING4甲基化狀態(tài)與CC中臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

基因表達(dá)的表觀遺傳修飾是環(huán)境暴露可能影響疾病的新機(jī)制，通過修飾調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)域表達(dá)。最近，有關(guān)表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在CC研究重要性的證據(jù)不斷涌現(xiàn)。DNA甲基化模式的改變，尤其是基因啟動(dòng)子區(qū)域的改變，可能對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。DNA甲基化的特征是在胞嘧啶-磷酸鳥嘌呤(CpG)島內(nèi)的胞嘧啶中添加了甲基。未甲基化的CpG島與轉(zhuǎn)錄活性區(qū)有關(guān)，而甲基化的DNA募集甲基結(jié)合蛋白，這些蛋白促進(jìn)染色質(zhì)聚集并阻止轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。有研究[12]報(bào)道，CC中ING4 mRNA 的表達(dá)水平明顯低于正常CC旁組織。ING4 可能通過抑制細(xì)胞生長，抑制腫瘤血管增生等途徑抑制腫瘤的生長。

ING4是具有249個(gè)氨基酸的生長抑制劑(ING4)家族的成員，該氨基酸由位于12q13-31號(hào)染色體上的基因編碼。 ING4包含3個(gè)核定位信號(hào)和1個(gè)高度保守的C端植物同源域(PHD)鋅指基序。通過消減雜交篩選，最初將ING鑒定為腫瘤抑制候選物。 ING4在多種細(xì)胞過程中起重要作用，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞衰老和凋亡[13-14]。此外，已經(jīng)證明ING4與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)相互作用以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。研究[15]表明，ING4與富含A-U的結(jié)合元件因子(AUF1)相互作用，從而下調(diào)原癌基因MYC。但是，仍需要闡明ING4對(duì)癌癥進(jìn)展的作用的分子機(jī)制。本研究檢測(cè)了對(duì)照組和CC組織標(biāo)本中ING4基因的甲基化模式。這些數(shù)據(jù)為本研究提供了一定的證據(jù)，CC組織中的ING4甲基化高于對(duì)照組，由此推測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化可能影響CC發(fā)生過程中的基因激活。

為了驗(yàn)證ING4產(chǎn)生的表觀遺傳調(diào)控的假說，根據(jù)MSP狀態(tài)評(píng)估，ING4啟動(dòng)子甲基化率為82.5%，對(duì)照組中甲基化率為12.0%，本研究表明CC組織中ING4 mRNA基因表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。且發(fā)生甲基化組ING4 mRNA表達(dá)較未發(fā)生甲基化組低。這些數(shù)據(jù)表明，ING4基因啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)可能是導(dǎo)致ING4 mRNA表達(dá)降低的一個(gè)原因，從而影響了CC的發(fā)生。盡管沒有在這項(xiàng)研究中調(diào)查整個(gè)表觀基因組，但很可能多個(gè)基因的表觀遺傳修飾參與CC發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示ING4基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化與CC患者的年齡、淋巴結(jié)狀態(tài)、病理學(xué)分類和CC的臨床分期等無明顯關(guān)聯(lián)。但是ING4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化表現(xiàn)出與ING4較低表達(dá)的顯著相關(guān)性。在后續(xù)的研究中，加大樣本量，同時(shí)進(jìn)一步研究更多細(xì)胞因子的甲基化狀態(tài)，以確定它們的甲基化狀態(tài)與CC發(fā)生之間的關(guān)系。此外，還需要認(rèn)識(shí)到ING4基因在CC的發(fā)生、發(fā)展和治療反應(yīng)中所起的關(guān)鍵作用。