聶建軍 潘保華 李彩萍 牛 宇 徐全飛 馮婉君 蒙秋霞

運用正交試驗法優(yōu)化褐黃木耳母種培養(yǎng)基的配方研究

聶建軍1潘保華1李彩萍1牛 宇1徐全飛1馮婉君1蒙秋霞2

（1. 山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所，太原 030006；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，太原 030006）

為篩選優(yōu)化褐黃木耳母種培養(yǎng)基配方，以菌絲日均長速為測量指標，菌絲長勢為參考項，通過單因素試驗，篩選出母種培養(yǎng)基最佳碳源和最佳氮源，并運用正交試驗法優(yōu)化配方。結(jié)果表明，褐黃木耳母種培養(yǎng)基最佳配方為蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂2%，pH自然。利用該配方培養(yǎng)，褐黃木耳菌絲色白、密實，平均生長速度3.82 mm/d，高于正交試驗和單因素試驗結(jié)果。

褐黃木耳；正交試驗；母種培養(yǎng)基；配方；優(yōu)化

褐黃木耳[(Mont.) Fari]隸屬擔子菌門、層菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬。夏、秋季發(fā)生在槭、樺、櫟等多種闊葉樹倒木上，單生或群生。子實體較小，平伏耳片狀，平滑或稍有脈狀皺紋，初期為柔軟的膠質(zhì)，有彈性，后略呈軟骨質(zhì)，光照強時呈琥珀紅色或淺紫紅色，光照弱時色澤淺，呈褐黃色或粉黃色，薄而透明，干后色變深，呈棕褐色，強烈收縮呈硬而脆的角質(zhì)至近革質(zhì)（圖1）。子實層生于下表面，背面被絨毛，污白色至淡黃褐色。子實體質(zhì)地嫩滑，具有降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗癌、抗細胞突變等多種功效，極具開發(fā)利用價值[1]。

圖1 野生褐黃木耳

褐黃木耳馴化和人工栽培技術的研究日益受到重視，但其母種培養(yǎng)基的篩選尚未見報道。本試驗初步篩選出母種培養(yǎng)基最佳碳源和最佳氮源，并利用正交試驗進行配方優(yōu)化，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生褐黃木耳子實體薄，采用耳木分離方法[2]。取長有野生木耳的耳木，鋸成3 cm厚的短木片，在接種室內(nèi)，將木片外表用火輕輕灼燒，殺死表面雜菌，用滅菌的刀片切去木片表皮層，取一小塊長有木耳菌絲的心材，移入PDA培養(yǎng)基試管中，接種的試管放于22～25 ℃、暗光、通氣良好的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，挑選菌絲濃密、色澤白、生長整齊的優(yōu)良菌株作為供試菌株。

1.2 培養(yǎng)基配方

①馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基[3]：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。

②綜合馬鈴薯葡萄糖（CPDA）培養(yǎng)基[4]：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，K2HPO40.3%，MgSO4·7H2O 0.1%，瓊脂2%。

③碳源供試培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，瓊脂2%，pH自然。

④氮源供試培養(yǎng)基：葡萄糖 2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，瓊脂2%，pH自然。

1.3 試驗方法

（1）菌種活化。將褐黃木耳菌種從冰箱中取出后，25 ℃下恒溫放置3天，在無菌條件下把活化菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，25 ℃下恒溫培養(yǎng)2～3天后挑取強壯菌絲前端，轉(zhuǎn)接于CPDA平皿培養(yǎng)基上，25 ℃下恒溫培養(yǎng)至表面長滿菌絲，作為試驗用菌種，備用。

（2）碳（氮）源篩選試驗。將葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉5種碳源分別加入碳源供試培養(yǎng)基中（濃度均為2%），進行碳源篩選試驗；將蛋白胨、酵母浸膏、尿素、硝酸銨、硫酸銨5種氮源分別加入氮源供試培養(yǎng)基中（濃度均為0.5%），進行氮源篩選試驗。每種碳（氮）源平皿培養(yǎng)基試驗重復6次，結(jié)果取平均值。

無菌條件下，用經(jīng)滅菌的打孔器（直徑5 mm）均勻截取經(jīng)活化的褐黃木耳菌種，分別接種于直徑為9 cm的不同碳（氮）源平皿培養(yǎng)基（溶化的培養(yǎng)基約25 mL）中央，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，3天后開始觀察菌絲生長情況，并采用十字交叉法測量菌落直徑，記錄菌絲長勢，連續(xù)觀測記錄10天。

（3）正交試驗優(yōu)化母種培養(yǎng)基配方。根據(jù)碳、氮源單因素試驗結(jié)果，把篩選出的最佳碳源、最佳氮源和無機鹽KH2PO4、MgSO4·7H2O 組成正交試驗9個不同處理的培養(yǎng)基，采用4因素3水平正交試驗法，優(yōu)化出褐黃木耳母種培養(yǎng)基最佳配方。

用經(jīng)滅菌的直徑5 mm打孔器均勻截取經(jīng)活化的褐黃木耳菌絲體組織塊，在無菌條件下分別接種于正交試驗9個不同處理的直徑為9 cm的平皿培養(yǎng)基（溶化的培養(yǎng)基約25 mL）中央，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。3天后開始連續(xù)10天觀察菌絲生長情況，并以接種塊為中心用十字交叉法測量菌落直徑（mm），隨機測量3 次，結(jié)果取平均值[5]，同時記錄菌絲長勢。

菌絲日均長速計算公式：= [(–5)/2]/。

式中：表示菌落直徑（mm），表示培養(yǎng)時間（d）。各試驗因素及其水平見表1。

表1 L9(34)正交實驗的因素和水平設計（%）

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行分析，多重比較采用鄧肯新復極差檢驗法（Duncan′s Multiple Ranger Test，DMRT）。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源篩選結(jié)果

由表2可以看出，在相同培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件下，以蔗糖作為碳源的菌絲平均長速較快，為2.92 mm/d，與其他4種碳源差異達極顯著水準。菌絲色白、密實。綜合比較，選擇蔗糖作為褐黃木耳母種培養(yǎng)基的最佳碳源。

表2 不同碳源和氮源的菌絲平均長速和菌絲長勢

注：①同列數(shù)據(jù)后小寫英文字母和大寫英文字母分別表示Duncan多重比較法檢測結(jié)果差異顯著性（=0.05，=0.01）；②致密、密實、細密、稀疏表示菌絲長勢依次減弱；③淀粉為可溶性淀粉。

2.2 氮源篩選結(jié)果

由表2可以看出，在相同培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件下，以酵母浸膏為氮源的培養(yǎng)基菌絲平均長速較快，為2.85 mm/d，與其他4種氮源差異達極顯著水準。菌絲色白、密實。綜合比較，選擇酵母浸膏作為褐黃木耳母種培養(yǎng)基的最佳氮源。

2.3 正交試驗優(yōu)化褐黃木耳母種培養(yǎng)基配方結(jié)果

從L9(34) 正交實驗結(jié)果與極差分析結(jié)果（表3）可知，影響褐黃木耳母種培養(yǎng)基配方的因素依次為（B）酵母浸膏>（A）蔗糖>（C）KH2PO4>（D）MgSO4·7H2O；褐黃木耳母種培養(yǎng)基最佳配方組合為A1B1C3D3，即最佳配方為蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂2%，pH自然。

表3 培養(yǎng)基配方正交試驗結(jié)果

2.4 最佳配方驗證試驗

對正交試驗結(jié)果所得的最佳配方（蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂2%，pH自然）進行6次重復試驗驗證，結(jié)果顯示，在其他條件相同情況下，利用該配方培養(yǎng)，菌絲均色白、密實，菌絲平均長速分別為3.86、3.78、3.91、3.85、3.72及3.81 mm/d，平均值3.82 mm/d，高于正交試驗和單因素試驗的每組結(jié)果。

3 結(jié) 論

碳源不僅是褐黃木耳合成菌體細胞必不可少的原料，也是其生命活動的能量來源，氮源則是合成蛋白質(zhì)和核酸的重要原料。褐黃木耳的生長發(fā)育還需要一定的無機鹽類，其中以磷、鉀、鎂3種元素尤為重要[6]。

通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)，褐黃木耳母種培養(yǎng)基的最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是酵母浸膏。運用正交實驗法優(yōu)化褐黃木耳母種培養(yǎng)基配方，結(jié)果最佳配方為蔗糖2%，酵母浸膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂2%，pH自然。

本研究是在篩選出褐黃木耳母種培養(yǎng)基單一碳源和氮源的基礎上進行的，關于選用復合碳源和氮源對母種培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，其菌絲生長特性有無改變，馴化栽培產(chǎn)量是否受影響，有待進一步研究探討。

[1] 潘保華, 聶建軍, 徐全飛, 等. 山西大型真菌野生資源圖譜[M]. 北京: 科學技術文獻出版社, 2018.

[2] 蘭進, 陳向東, 曾念開. 名貴藥用真菌栽培技術問答[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2014.

[3] 田夢媛, 高原, 杜雙田, 等. 27個香菇菌株農(nóng)藝性狀比較研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報, 2019, 24(1): 82-91.

[4] 陳立佼, 柴紅梅, 黃興奇, 等. 尖頂羊肚菌單孢菌株群體培養(yǎng)特性研究[J]. 生物技術, 2011, 21(6): 63-70.

[5] 劉娜, 宋瑩, 呂立濤, 等. 5株梯棱羊肚菌菌絲生長特性研究[J]. 中國食用菌, 2019, 38(9): 21-28.

[6] 方芳, 宋金娣, 馮吉慶, 等. 食用菌生產(chǎn)大全[M]. 南京: 江蘇科學技術出版社, 2007.

Optimum of stock culture medium formula ofby orthogonal test

Nie Jianjun1Pan Baohua1Li Caiping1Niu Yu1Xu Quanfei1Feng Wanjun1Meng Qiuxia2

（1.Institute of Agricultural Resources & Economy, Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan, Shanxi 030006, China；2. Institute of Agricultural Environment & Resources , Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan, Shanxi 030006, China）

Taking the average daily growth rate of hypha as the measurement index and hypha growth potential as the reference item, the best carbon source and the best nitrogen source ofstock culture medium were selected through single factor experiment, and the formula of stock culture medium was optimized by orthogonal test. The results showed that the optimal formula of stock culture medium forwas: sucrose 2%, yeast extract 0.5%, KH2PO40.3%, MgSO4·7H2O 0.15%, agar 2%, and natural pH.

; orthogonal test; stock culture medium; formula; optimization

S646

B

2095-0934（2020）05-318-04

山西省農(nóng)業(yè)科學院山西“農(nóng)谷”研發(fā)專項資助項目（YCX2018204）；山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與示范推廣資助項目（2019CGZH07-2）；山西省重點研發(fā)計劃（農(nóng)業(yè)）資助項目（201803D221011-1）；山西省重點研發(fā)計劃資助項目（201903D221046）

聶建軍（1969—），男，副研究員，現(xiàn)主要從事食藥用菌等研究工作。E-mail：njjj666@126.com。