田媛，王力，龍鳳，昝林森,2，成功,2

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2國家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100）

0 引言

【研究意義】抗生素濫用所引發(fā)的細菌耐藥性、抗生素殘留及食品安全等問題已被視為全球危害公眾健康的問題，人們迫切需要開發(fā)新型廣譜抗菌劑。溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，在唾液、淚液、血清、人乳、牛乳和禽類蛋清中廣泛分布，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，具有廣譜抗菌、消炎、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種功效，在畜牧、農(nóng)產(chǎn)品、食品和醫(yī)療等行業(yè)廣泛應(yīng)用[1-3]。人溶菌酶和雞蛋清溶菌酶氨基酸序列具有59%同源性，但抗菌活性遠高于目前使用較廣的雞蛋清溶菌酶，具有更廣闊的應(yīng)用前景[4]。然而，通過傳統(tǒng)方法從母乳、胎盤、唾液中提取分離或微生物表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組人溶菌酶，獲得量很少，穩(wěn)定性低，無法滿足研究和潛在市場應(yīng)用的需求[5]?；蚬こ滩粩喟l(fā)展為大規(guī)模高效生產(chǎn)重組人溶菌酶提供了可能。因此，進一步優(yōu)化表達系統(tǒng)，通過生物反應(yīng)器實現(xiàn)重組人溶菌酶高效表達，將為今后重組人溶菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】2006年，MEGA首次利用山羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)了重組人溶菌酶[6]，隨后在牛[7-9]、豬[10]、山羊[11]等動物的研究中均有成功實現(xiàn)了重組人溶菌酶在乳腺中表達的報道。然而，不容忽視的是，異源重組蛋白表達量低是目前生物反應(yīng)器中亟待解決的難題。研究發(fā)現(xiàn)，宿主細胞密碼子使用偏好很大程度上影響了異源重組蛋白在宿主細胞的高效表達[12]。組成蛋白質(zhì)的氨基酸有 20種，而編碼氨基酸的密碼子有64種（簡并密碼子）。不同生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其中使用頻率高密碼子稱為最佳密碼子，而那些很少被利用的密碼子稱為稀有或低頻密碼子。研究發(fā)現(xiàn)，少量的 DNA密碼子的改變，在很大程度上影響了蛋白翻譯速率，即使替換單個簡并密碼子，其蛋白合成的速度會減緩到其正常速度的1/10甚至更慢[13]，密碼子使用偏好與蛋白翻譯效率呈顯著正相關(guān)[14]。通過蛋白質(zhì)和mRNA表達數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，密碼子的選擇決定了蛋白的表達量，生物體通過密碼子的選擇進而調(diào)控內(nèi)源蛋白的表達豐度[15]。密碼子的選擇在生物反應(yīng)器研究過程中十分重要，外源基因含有宿主細胞基因使用的低頻密碼子或者偏好密碼子不一致情況下，往往會影響外源基因的mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，造成重組蛋白表達量低[16]。前人研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因山羊、牛乳腺中重組人乳鐵蛋白表達量為 1.5—30 g·L-1，而重組人溶菌酶的表達量只有0.025—0.27 g·L-1[17]，表達量低造成提純成本高，難以達到乳腺生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)要求。【本研究切入點】因此，人溶菌酶基因密碼子使用偏好性是否與牛主要乳蛋白密碼子使用偏好一致？這種差異是否是導(dǎo)致人溶菌酶在乳腺生物反應(yīng)器中表達量低的主要原因？密碼子優(yōu)化能否進一步提高重組人溶菌酶表達量？這些問題仍待進一步研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗通過對牛乳腺主要乳蛋白密碼子使用偏好性進行分析，并根據(jù)牛乳蛋白高頻密碼子和低頻密碼子對人溶菌酶基因密碼子進行翻譯起始區(qū)優(yōu)化和全局優(yōu)化設(shè)計，通過熒光素酶、實時熒光定量PCR及Western-blot等方法從mRNA和蛋白水平對密碼子優(yōu)化效果進行分析比較，實現(xiàn)人溶菌酶基因的高效表達，為開展重組人溶菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于 2019年在西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心實驗室完成。

1.1 材料

PGL3-Basic熒光素酶載體、海腎熒光素酶載體為實驗室保存。E.coliDH 5a菌株和pMD19-T easy載體購自大連Takara公司。牛成纖維細胞通過耳組織塊法分離獲得，實驗室凍存。牛乳腺上皮細胞系購自通派（上海）生物科技有限公司，小鼠乳腺上皮細胞系C127購自北京協(xié)和細胞庫。主要試劑包括：高保真PCR酶、限制性內(nèi)切酶、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix EX Taq定量PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA連接酶、Dual-Glo雙熒光素酶檢測試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；Endo-free Plasmid Kit、膠回收試劑盒購自O(shè)mega Biotek股份有限公司；Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑及 opti-MEM 購自Invitrogen公司；Western-blot細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒及SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏公司。兔源溶菌酶多抗、兔源GAPDH單抗和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗分別購自Santa Cruz（sc-292849），Abcam（ab181603）和生工生物工程（上海）股份有限公司（D110058）。

1.2 牛主要乳蛋白基因和人溶菌酶基因密碼子使用偏好分析

選取 αs1、αs2、β、κ-酪蛋白，β-乳球蛋白，α-乳清白蛋白，乳鐵蛋白等7種牛乳中主要乳蛋白基因CDS序列，用于密碼子使用偏好性分析。具體乳蛋白基因名稱、GenBank登錄號、CDS序列長度見表1。

表1 7種牛乳蛋白基因GenBank登錄號及序列信息Table 1 GenBank accession number and sequence information of cattle seven milk protein genes

利用 CodonW1.42和 EMBOSS（http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/）中CUSP、CHIPs等工具對牛主要乳蛋白基因密碼子及人溶菌酶密碼子使用特性進行分析。分析的特性參數(shù)主要包括：A3s，G3s，C3s，同義密碼子在第 3 位上相應(yīng)堿基的出現(xiàn)頻率（T3s）、基因的G+C含量（GC）、密碼子第3位的G+C 含量（GC3s）、密碼子適應(yīng)性指數(shù)（CAI）、有效密碼子數(shù)（ENc）等。同義密碼子的相對使用度（RSCU）是對同義密碼子的使用偏好性評估，該值等于同義密碼子的實際觀測值與同義密碼子平均使用期望值的比值。如果密碼子使用無偏好性，則RSCU值為1；如該密碼子比其他同義密碼子使用更頻繁，則其 RSCU值大于1，反之亦然。將7個牛乳蛋白基因和人溶菌酶基因各自作為一個對象，以密碼子的RSCU 值作為變量，對應(yīng)每個編碼氨基酸密碼子利用TBtools 0.665繪制熱圖并進行聚類分析。

1.3 溶菌酶密碼子優(yōu)化及基因克隆

根據(jù)牛主要乳蛋白基因密碼子使用偏好性，對人溶菌酶基因局部（翻譯起始區(qū)前22位密碼子）和全局優(yōu)化設(shè)計。利用mfold在線軟件對優(yōu)化后的人溶菌酶基因序列進行RNA二級結(jié)構(gòu)分析（http://unafold.rna.albany.edu/）。

采用Trizol 法提取人Hela細胞總RNA, 通過凝膠電泳和核酸定量檢測 RNA質(zhì)量和濃度。根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明對RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，利用P-pGL3-cw引物（表 2）克隆獲得人溶菌酶編碼區(qū)序列（野生型溶菌酶序列，LYZcw）。反應(yīng)條件為：98 ℃，30 s模板變性；98℃，5 s；57℃，15 s；72℃，15 s，30個循環(huán)。72℃，5 min延伸。以LYZcw cDNA為模板，利用P-pGL3-op22引物（表2）克隆獲得翻譯起始區(qū)密碼子優(yōu)化序列（LYZop22），PCR反應(yīng)條件同上。對上述獲得的LYZcw、LYZop22PCR產(chǎn)物經(jīng)過膠回收純化、序列末端加A反應(yīng)、T-A克隆并DH5α轉(zhuǎn)化后進行測序驗證（LYZcw-T、LYZop22-T）。全局密碼子優(yōu)化的溶菌酶序列（LYZop），經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成并克隆到 T載體中（LYZop-T）。

表2 LYZcw、LYZop22、LYZop序列克隆引物信息及基因合成Table 2 Primers for the amplication of LYZcw, LYZop22 and LYZop

1.4 pGL3-LYZcw/op22/op溶菌酶-熒光素酶融合表達構(gòu)建

以Invitrogen公司pGL3-control載體為骨架載體，構(gòu)建人溶菌酶基因與螢火蟲熒光素酶基因融合表達載體。通過NcoI內(nèi)切酶分別酶切LYZcw-T、LYZop22-T、LYZop- T和pGL3-control載體。1%瓊脂糖凝膠電泳回收LYZcw、LYZop22、LYZop溶菌酶基因序列和線性化的pGL3-control載體。通過T4 DNA連接酶進行連接，分別構(gòu)建pGL3-LYZcw/op22/op熒光素酶融合表達載體。測序篩選鑒定LYZcw/op22/op序列以正向插入并與螢火蟲熒光素酶基因正確融合的質(zhì)粒用于下一步研究。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶檢測密碼子優(yōu)化效果

分別將實驗室凍存的牛乳腺上皮細胞系（BMEC）、牛成纖維細胞（BFFC）及C127小鼠乳腺上皮細胞系復(fù)蘇，用完全培養(yǎng)基（DMEM高糖+10% FBS +1% PS）重懸，接種到T75培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞匯合度達到 90%時進行傳代接種于24孔培養(yǎng)板中（2×105/孔）。接種后的第二天，按照每孔 0.8 μg質(zhì)粒（PGL-LYZcw/LYZop/LYZop22∶pRL-tk = 10∶1）：2 μLlipo3000比例轉(zhuǎn)染上述細胞，每組4個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后通過熒光素酶活性檢測比較人溶菌酶密碼子優(yōu)化效果。

1.6 pcDNA3.1-LYZcw/op22/op溶菌酶過表達載體構(gòu)建

分別以pGL3-LYZcw/op22/op質(zhì)粒為模板，利用P-pcDNA-cw、P-pcDNA-op22、P-pcDNA-op引物（表2）克隆LYZcw、LYZop22、LYZop序列（PCR反應(yīng)條件參照1.3）并連接到T載體。使用HindIII、XhoI內(nèi)切酶分別酶切pcDNA3.1（+）、LYZcw-T、LYZop22-T vector、LYZop- T，連接構(gòu)建 pcDNA-LYZcw/op22/op人溶菌酶過表達載體，測序做進一步鑒定。

1.7 細胞轉(zhuǎn)染及實時熒光定量 PCR檢測密碼子優(yōu)化效果

將培養(yǎng)的牛成纖維細胞（BFFC）、牛乳腺上皮細胞（BMEC）及C127細胞傳代接種于12孔培養(yǎng)板中（2×105/孔）。接種后的第二天，按照lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，每孔 1.6 μg質(zhì)粒（pcDNA 空載、pcDNA-LYZcw/op22/op）：4 μL lipo3000 比例轉(zhuǎn)染上述細胞，每組4個復(fù)孔。24 h后按照1.3中方法提取細胞總 RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，用于下一步定量PCR檢測。

對不同密碼子優(yōu)化方式對重組人溶菌酶 mRNA水平表達量進行定量分析。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃，30 s。95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40 個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后進行熔解曲線分析，確保擴增條帶單一。

1.8 Western-blot檢測密碼子優(yōu)化效果

將培養(yǎng)的牛乳腺細胞（BMEC）經(jīng)胰酶消化后接種于6孔培養(yǎng)板中（4×105/ 孔）。接種后的第二天，按照 lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，每孔 4.0 μg質(zhì)粒（pcDNA 空載、pcDNA-LYZcw/op22/op）：10 μL lipo3000比例轉(zhuǎn)染上述細胞，每組4個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后，收集蛋白用于Western-blot檢測。蛋白電泳采用分離膠濃度為12%，蛋白上樣量40 μg。電泳條件為濃縮膠80 V，分離膠120 V，待溴酚藍跑出膠后終止電泳。蛋白轉(zhuǎn)膜按照伯樂半干轉(zhuǎn)膜儀操作說明，200 mA, 1h進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉——一抗4 ℃孵育過夜（人溶菌酶、GAPDH 1∶1 000稀釋）——TBST洗滌（3次，每次10 min）——二抗室溫孵育2 h（1∶3 000稀釋）——TBST洗滌（3次，每次10 min）——顯影——ChemiDoc XRS+儀器成像。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct方法對real-time qPCR 分析計算目的基因相對表達量。GraphPad Prism 6.0進行 One-way ANOVA分析和作圖。數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示。

2 結(jié)果

2.1 牛乳蛋白及人溶菌酶基因密碼子組成分析

通過CodonW軟件對牛乳蛋白及人溶菌酶基因密碼子組成進行分析，結(jié)果表明，牛乳蛋白基因密碼子 GC含量平均為 0.485 ± 0.026，第三位堿基GC3s含量平均為0.537 ± 0.062。人溶菌酶基因密碼子GC含量為0.473，第三位堿基GC3s含量為0.407。上述結(jié)果表明，人溶菌酶基因整體 GC含量與牛乳蛋白基因GC含量相近，但第三位堿基GC含量低于牛乳蛋白基因 GC含量。牛乳蛋白基因密碼子偏好以 GC結(jié)尾，而人溶菌酶基因密碼子偏好以 AT結(jié)尾（表3）。

ENc值范圍為20（每個氨基酸只使用一個密碼子）到61（各個密碼子被均衡使用），其值越低，偏好性越強。牛乳蛋白及人溶菌酶ENc值分別為49.814和50.27，表明牛乳蛋白和人溶菌酶基因密碼子使用相對較平均。ENC vs GC3s線性回歸分析結(jié)果表明，7種乳蛋白基因有效密碼子數(shù) ENc值與第三位堿基GC3s呈顯著負相關(guān)（R= - 0.8968，P＜0.01）（圖1），表明密碼子使用偏好性越強（ENc值越?。┑幕?，其GC3s值越高，主要偏好以GC堿基結(jié)尾的密碼子。因此，牛乳蛋白基因密碼子的使用偏好性受GC3s影響。

2.2 牛乳蛋白基因密碼子使用偏好性分析

對編碼氨基酸且為簡并密碼子的7種牛乳蛋白基因使用的共59個密碼子（不含Met、Trp及3個終止密碼子）進行同義密碼子的相對使用度（RSCU）分析。結(jié)果表明，牛乳蛋白基因?qū)TG（2.71）、AGG（2.32）、GCC（1.73）、GTG（1.68）、ATC（1.64）等5個密碼子具有明顯的偏好性（RSCU＞1.5），為高頻密碼子。而 TTA（0.12）、ATA（0.18）、TCG（0.19）、CTA（0.25）、CCG（0.26）、GCG（0.45）、ACG（0.48）等7個密碼子在牛乳蛋白基因中使用較?。≧SCU＜0.5），為低頻密碼子（表4）。

表4 牛乳蛋白基因密碼子使用偏好性分析Table 4 Codon preference analysis of bovine milk protein genes

圖1 牛乳蛋白基因ENc vs GC3s相關(guān)性分析Fig. 1 Correlation analysis of ENc vs GC3s of bovine milk protein genes

2.3 基因密碼子偏好性的聚類分析

以密碼子的RSCU 值作為變量，對具有簡并性的59個編碼氨基酸的密碼子進行聚類分析。依據(jù)RSCU值可以將7種牛乳蛋白較好的分成為兩大類：酪蛋白類（CSN2、CSN1S2、CSN3和CSN1S1）和乳清蛋白類（LTF、LGB和 LALBA），而人溶菌酶基因密碼子使用偏好與牛乳酪蛋白類更接近（圖 2）。結(jié)果表明，即使在同一乳腺組織內(nèi)，編碼牛乳酪蛋白類基因密碼子和乳清蛋白類基因密碼子在使用偏好性上可能也存在一定差異。

2.4 人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化及分析

根據(jù)表3結(jié)果中牛乳蛋白基因高頻密碼子及低頻密碼子使用情況，對人溶菌酶密碼子進行了優(yōu)化。其中LYZop對溶菌酶全局密碼子進行了優(yōu)化，而 LYZop22只對翻譯起始區(qū)前22位密碼子進行了優(yōu)化（表5）。

表5 人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化情況Table 5 Codon Optimization of human lysozyme gene

圖2 牛乳蛋白及人溶菌酶基因密碼子使用RSCU值聚類分析Fig. 2 Clustering analysis of bovine milk protein and human lysozyme genes based on RSCU value

CodonW比較優(yōu)化前后序列，結(jié)果表明，LYZcw、LYZop22、LYZop第三位堿基即 GC3s含量分別為0.407、0.450、0.757。mRNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能MFE從-138.83 kcal/mol（LYZcw）分別降低到了-141.02 kcal/mol（LYZop22）和-178.12 kcal/mol（LYZop），mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性明顯提高。對mRNA翻譯起始區(qū)100個堿基進行二級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)相比于LYZcw（-29.7 kcal/mol），LYZop22（-26.4 kcal/mol）和 LYZop（-31.0 kcal/mol）密碼子優(yōu)化并沒有明顯改變翻譯起始區(qū)二級結(jié)構(gòu)最小自由能，相反在5′端引入了更多的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖3），有利于核糖體與mRNA的結(jié)合并啟動翻譯。

圖3 人溶菌酶密碼子優(yōu)化翻譯起始區(qū)（1-100 bp）mRNA二級結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 3 Schematic diagram of RNA second structure of codon optimized human lysozyme gene (1-100bp)

2.5 人溶菌酶-熒光素融合載體構(gòu)建及溶菌酶表達分析

電泳和測序結(jié)果表明，成功克隆到了人溶菌酶野生型LYZcw、翻譯起始區(qū)密碼子優(yōu)化的LYZop22 CDS區(qū)序列及全基因合成的全局密碼子優(yōu)化的 LYZop CDS區(qū)序列，且與預(yù)期序列信息一致（圖4）。Nco1酶切和測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了 pGL3-LYZcw/op22/op 3個人溶菌酶-熒光素酶融合表達載體，且LYZcw、LYZop22、LYZop編碼區(qū)與螢火蟲熒光素酶基因正確融合，沒有移碼突變（圖5）。

圖4 LYZcw、LYZop22和LYZop電泳檢測Fig. 4 LYZcw, LYZop22 and LYZop electrophoresis detection

圖5 pGL3-LYZcw/op22/op載體Nco1酶切鑒定Fig. 5 pGL3-LYZcw/op22/op vector identified by Nco1 enzyme digestion

通過lipo3000 將pGL-LYZcw+pRL-tk、pGL-LYZop+ pRL-tk、pGL-LYZop22 + pRL-tk分別轉(zhuǎn)染BMEC、BFFC、C127細胞，48 h后檢測熒光素酶表達量。熒光素酶檢測結(jié)果表明，相比LYZcw，全局密碼子優(yōu)化的LYZop在BMEC和對照BFFC、C127細胞中分別提高了2.20倍（P＜0.01）、2.44倍（P＜0.01）和1.99倍（P＜0.01）。翻譯起始區(qū)密碼子優(yōu)化的 LYZop22在BMEC細胞中相比野生型提高了1.48倍（P＜0.01），而在對照BFFC、C127細胞中差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。

2.6 mRNA、蛋白水平檢測人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化效果

構(gòu)建 pcDNA-LYZcw/op22/op過表達載體，并分別轉(zhuǎn)染BMEC、BFFC和C127細胞，檢測密碼子優(yōu)化對人溶菌酶mRNA表達量的影響。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC細胞中分別提高了2.08倍（P＜0.05）和1.5倍（P＞0.05）。而LYZop相比野生型LYZcw在上述兩個細胞中分別提高了17.8倍（P＜0.01）和22倍（P＜0.01）（圖 7）。上述結(jié)果表明，根據(jù)牛乳腺主要蛋白進行密碼子優(yōu)化后的溶菌酶能顯著提高其在牛乳腺上皮細胞和成纖維細胞轉(zhuǎn)錄水平表達量。

進一步對 pcDNA-LYZcw/op22/op過表達載體轉(zhuǎn)染的牛BMEC細胞進行人溶菌酶蛋白表達檢測。相比野生型LYZcw，密碼子優(yōu)化的LYZop、LYZop22明顯提高了人溶菌酶在牛BMEC細胞中的表達量，且全局密碼子優(yōu)化的 LYZop溶菌酶表達量高于翻譯起始區(qū)密碼子優(yōu)化的LYZop22（圖8-A）。上述結(jié)果表明，密碼子優(yōu)化能明顯提高人溶菌酶在牛乳腺上皮細胞中的表達。然而，經(jīng)全局密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因在牛乳腺上皮細胞中蛋白表達水平提高倍數(shù)低于mRNA水平提高倍數(shù)（圖8-B）。

圖6 熒光素酶檢測人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化效果Fig. 6 The effect of codon optimization analysis of human lysozyme gene by luciferase

圖7 mRNA水平檢測人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化效果Fig. 7 The effect of codon optimization analysis on human mRNA level of human lysozyme gene

3 討論

人溶菌酶作為非特異性免疫因子，對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等均具有廣譜的抗菌作用，在體內(nèi)發(fā)揮著殺菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、改善胃腸道菌群的作用。同時，在畜牧、農(nóng)產(chǎn)品、食品、醫(yī)療和化妝品輕工等行業(yè)也具有廣泛應(yīng)用前景。利用現(xiàn)代基因工程和乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人溶菌酶克服了傳統(tǒng)提取方法蛋白穩(wěn)定性差、成本高的不足，但如何進一步提高重組蛋白的表達量并用于下一步工業(yè)化生產(chǎn)仍是乳腺生物反應(yīng)器首要考慮的問題。

圖8 蛋白水平檢測密碼子優(yōu)化對人溶菌酶表達量的影響Fig. 8 The effect of codon optimization analysis on protein level of human lysozyme

近年來研究發(fā)現(xiàn)，不同生物密碼子的選擇不僅對蛋白高水平表達發(fā)揮作用，同時對微量的調(diào)控蛋白表達也起到調(diào)節(jié)作用[13]，這一發(fā)現(xiàn)對于提高外源重組蛋白的表達和生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。研究發(fā)現(xiàn)，同一物種，不同組織甚至同一組織內(nèi)不同蛋白其密碼子使用偏好性均存在差異，正是這種差異可能進一步調(diào)節(jié)著蛋白的表達量[18]。本研究中根據(jù)牛乳中7種主要乳蛋白基因密碼子偏好性進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，牛乳中酪蛋白類（CSN2、CSN1S2、CSN3和CSN1S1）和乳清蛋白類（LTF、LGB和 LALBA）可以明顯的分為兩類。表明，同一組織內(nèi)牛乳酪蛋白和乳清蛋白基因密碼子使用偏好存在一定的差異，而這種密碼子使用偏好性可能在一定程度上影響著牛乳酪蛋白和乳清蛋白表達量。密碼子使用偏好性分析發(fā)現(xiàn)，牛乳蛋白基因中發(fā)現(xiàn)5個高頻密碼子和7個低頻密碼子，且牛乳蛋白基因密碼子第三位堿基偏好以GC結(jié)尾，而人溶菌酶偏好以AT結(jié)尾。而較高的GC含量，特別是簡并堿基GC含量在哺乳動物細胞中與mRNA豐度和蛋白表達量呈正相關(guān)[19-20]。表明，人溶菌酶密碼子使用偏好性不利于在牛乳中高效表達，這也可能是造成牛乳腺生物反應(yīng)器中重組人溶菌酶表達量低的主要原因[17, 21]。

密碼子使用偏好性在調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性、蛋白翻譯起始、延伸等方面發(fā)揮了重要的作用[22-23]。本研究中局部和全局密碼子優(yōu)化后的人溶菌酶 mRNA二級結(jié)構(gòu)自由能 MFE分別由-138.83 kcal/mol降低到了-141.02 kcal/mol和-178.12 kcal/mol。前人研究發(fā)現(xiàn)，mRNA折疊強度與 mRNA豐度和蛋白表達量呈正相關(guān)[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著密碼子優(yōu)化后人溶菌酶mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的增加，其mRNA表達量也相應(yīng)提高。在牛BMEC等3種細胞中，全局密碼子優(yōu)化的人溶菌酶 mRNA水平顯著高于局部密碼子優(yōu)化的人溶菌酶，這一結(jié)果也與優(yōu)化后 mRNA 穩(wěn)定性呈正相關(guān)。表明，密碼子優(yōu)化可能通過增加mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和 mRNA轉(zhuǎn)錄效率進而提高了人溶菌酶mRNA表達水平。

研究發(fā)現(xiàn)，mRNA 二級結(jié)構(gòu)5′端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)有利于蛋白翻譯起始和延伸，進而提高蛋白表達量[26-27]。密碼子優(yōu)化后的溶菌酶盡管整體mRNA MFE明顯降低，但進一步對 5′端翻譯起始后 100 bp mRNA堿基進行二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，密碼子優(yōu)化并沒有明顯改變?nèi)巳芫富蚯?00bp 二級結(jié)構(gòu)自由能，反而在翻譯起始區(qū)引入了更多的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而5′端莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引入，有利于提高蛋白翻譯起始效率[28]。釀酒酵母中研究發(fā)現(xiàn)，蛋白表達豐度與 mRNA折疊強度存在正相關(guān)，而有效的 mRNA翻譯起始效率和較高的 mRNA二級結(jié)構(gòu)縮短了核糖體之間的距離，使 mRNA的翻譯效率提高，進而提高了蛋白的表達豐度[25,29]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，翻譯區(qū)密碼子優(yōu)化后牛 BMEC和 BFFC細胞中人溶菌酶基因mRNA水平和蛋白水平相比野生型都有一定程度的提高。全局密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因，在mRNA翻譯起始區(qū)引入了更多的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，同時，mRNA整體折疊也更穩(wěn)定。因此，密碼子優(yōu)化后的人溶菌酶表達量在 mRNA 水平和蛋白水平相比野生型均得到明顯的提高。

密碼子優(yōu)化是提高外源重組蛋白表達的重要途徑之一。盡管目前已開發(fā)許多軟件可根據(jù)宿主密碼子使用偏好對目的基因密碼子進行優(yōu)化和設(shè)計，然而關(guān)于密碼子優(yōu)化的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍未統(tǒng)一，密碼子優(yōu)化的效果也不盡如人意，歸根結(jié)底是由于目前關(guān)于密碼子優(yōu)化是如何影響外源蛋白表達仍存在很大的爭議。密碼子優(yōu)化在mRNA轉(zhuǎn)錄效率[30]、穩(wěn)定性[31]，蛋白翻譯起始[32]、延伸效率、蛋白折疊及蛋白穩(wěn)定性[33]等多個環(huán)節(jié)均發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用。ZHOU等研究發(fā)現(xiàn)，密碼子優(yōu)化提高了目的基因蛋白和RNA表達水平，但主要是體現(xiàn)在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的提高[30]。PRESNYAK 等[31]認為，密碼子優(yōu)化是決定 mRNA穩(wěn)定性的主要因素。本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)全局密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性得到明顯提高，其在牛乳腺上皮細胞中轉(zhuǎn)錄水平提高了17.8倍，然而其蛋白水平提高倍數(shù)卻低于mRNA水平提高倍數(shù)。表明，密碼子優(yōu)化大幅提高了重組人溶菌酶mRNA的表達水平，但mRNA表達水平與蛋白表達水平并不一定呈強相關(guān)[34]，而mRNA轉(zhuǎn)錄后的修飾可能進一步影響了蛋白的表達。因此，通過密碼子優(yōu)化提高mRNA表達水平的同時如何進一步提高蛋白表達水平及其內(nèi)在分子機制仍有待于進一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)分析了牛乳腺主要乳蛋白基因密碼子使用偏好，獲得了牛乳蛋白基因密碼子使用偏好及使用的高低頻密碼子；依據(jù)牛乳蛋白基因密碼子使用偏好性對人溶菌酶全局密碼子優(yōu)化能顯著提高重組人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表達量，為今后利用生物反應(yīng)器高效生產(chǎn)重組人溶菌酶奠定基礎(chǔ)。