任曉曄

（蘇州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇蘇州 215000）

1 切膠回收PCR產(chǎn)物

1.1 試劑組成

凝膠溶化劑、結(jié)合液、洗滌液、去鹽液、洗脫液

1.2 注意事項

盡量切去含有DNA片段的凝膠，切膠動作要迅速；凝膠塊必須完全溶化；

在洗脫時，洗脫液加熱至65℃，提高洗脫率。

1.3 操作步驟

（1）取大約150ul的PCR產(chǎn)物。

（2）在紫外燈下切下含有DNA片段的凝膠并切碎，裝入1.5ml的離心管中。

（3）加入3個體積的溶化劑，混合均勻水浴鍋加熱至凝膠完全融化。

（4）加入0.5個熔化劑體積的結(jié)合液，混合均勻。藍耳病片段大小為372bp因此要加入要加入1個凝膠體積的異丙醇。

（5）放入制備管12000r/m，離心1min，棄濾液。

（6）加入500μl 洗滌液，12000r/m，離心30s，棄濾液

（7）加入700μl 去鹽液，12000r/m，離心30s，棄濾液。

（8）將制備管放入新的1.5ml離心管中，加入25μl的洗脫液，室溫靜至1min，12000r/m，離心1min洗脫DNA。

2 插入表達載體pEASY-E1

吸取膠回收到的PCR產(chǎn)物4μl，加入pEASY-E1 1ul，輕輕混勻，為增加陽性克隆的機率室溫30℃反應10min，反應結(jié)束后置于冰上。

3 轉(zhuǎn)化

3.1 實驗準備

（1）LB：酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉10g定容至1L 。

（2）LB培養(yǎng)基：酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉10g、瓊脂15g定容至 1L 。

（3）濃度100mgml的 氨芐青霉素。

（4）耗材：冰盒、培養(yǎng)皿、接種棒、酒精燈等。

（5）儀器：干式恒溫器、微型振蕩培養(yǎng)箱、水浴鍋。

（6）試劑：Transl-T1感受態(tài)細胞。

3.2 注意事項

（1）LB及LB培養(yǎng)基、超純水、槍頭、脂形管和培養(yǎng)皿高壓滅菌30min。

（2）實驗前雙手消毒，操行臺滅菌。

（3）實驗中使用的耗材要在酒精燈火焰上滅菌。

（4）細菌涂板要均勻，并倒放。

3.3 操作步驟

（1）在培養(yǎng)基凝固前倒入培養(yǎng)皿中。4℃保存?zhèn)溆?，倒放?/p>

（2）加上一步驟中的產(chǎn)物50μl在感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴 20～30min。

（3）42℃準確熱激30s，立即置于冰上。

（4）加入250μl平衡至室溫的LB，置于搖床上200轉(zhuǎn)，37℃孵育1h。

（5）在鋪好的培養(yǎng)皿上先涂25μl AMP。

（6）取菌液涂板，鋪2塊，25μl一塊，37℃過夜培養(yǎng)。

（7）用接種棒挑取單個菌落進行擴大培養(yǎng)，兩塊板共取16個單個菌落，放入1ml LB中，37℃、200轉(zhuǎn)培養(yǎng)1h。

（8）鑒定菌落是否是陽性，吸取再培養(yǎng)的菌液2μl跑PCR，16個菌落中2、8、9、13號出現(xiàn)條帶，并吸取每個250μl菌液送去測序。PCR法可行，但不一定成功，因為Tm的退火溫度不一定，最終要以測序結(jié)果為準。

（9）取上述陽性菌種再培養(yǎng)，涂板，37℃過夜培養(yǎng)。

（10）挑取再培養(yǎng)的菌落，放入10ml的LB中，37℃200轉(zhuǎn)4h培養(yǎng)，提質(zhì)粒時使用。

4 提取質(zhì)粒插入表達載體

4.1 試劑組成

溶液P1、P2、P3、平衡液、去蛋白液、漂洗液、洗脫液。

4.2 操作步驟

（1）在吸附柱中加入500μl的平衡液，12000轉(zhuǎn)離心1min。

（2）取5ml菌液，12000轉(zhuǎn)離心1min，棄上清。

（3）加250μl的P1，混勻。

（4）加 250μl的P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次。

（5）加350μl的P3，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻，出現(xiàn)白色絮狀物，再12000轉(zhuǎn)離心10min，取上清。

（6）將上清放入吸附柱中，12000轉(zhuǎn)離心30s，棄廢液。

（7）加500μl去蛋白液，12000轉(zhuǎn)離心30s，棄廢液。

（8）加600μl漂洗液，12000轉(zhuǎn)離心30s，棄廢液，重復一次。

（9）吸附柱直接12000轉(zhuǎn)離心2min，開蓋靜至5min。

（10）將吸附柱放入新的離心管中，加50μl洗脫液，室溫靜置2min，12000轉(zhuǎn)離心2min。

5 插入BL21感受態(tài)細胞步驟同上。

6 IPTG的誘導表達——通過不同的誘導時間決定最佳的表達條件

6.1 實驗步驟

（1）取一支凍存的陽性菌種加入1ml LB復蘇。

（2）取4支15ml脂形管（編號為1、2、3、4號）分別放入10ml LB（每支加10μl Amp），每支加入復蘇菌液50ml，37℃200轉(zhuǎn)培養(yǎng)直到OD600時的讀數(shù)為0.6～1.0時，從1號中吸取2ml做對照。

（3）將 2、3、4號加入IPTG（濃度為50mg/ml，每8ml中加16μl IPTG），37℃培養(yǎng)。2h后取出2號菌液1ml備用。

（4）1h后取出3號菌液1ml備用，1h再后取出4號菌液。

（5）將上述吸出的菌液12000轉(zhuǎn)離心2min，吸出上清，沉淀用20mM PB溶解，上清和沉淀 -20℃保存。

（6）反復凍融上清和細菌沉淀3次以上。

7 SDS-page電泳

7.1 電泳液

成品SDS-page電泳液直接加入1L超純水。

7.2 制膠

12%的分離膠+5%的濃縮膠（表1）。

7.3 實驗步驟

（1）先配置分離膠，按順序加入溶液，每加完一個搖晃一下。

（2）TEMED在通風櫥中加，加入后混勻30s后再注膠，不要有氣泡，分離膠注好后用水封頂，聚合40min。

（3）加入濃縮膠后插梳子，斜著插入，避免氣泡，聚合40min。

（4）分離膠和濃縮膠界面做好標記，分離膠加8.5ml，濃縮膠加1.5ml。

表1

7.4 上樣

（1）把之前反復凍融的菌液和上清取出，解凍后各取10μl，加入2μl的上樣緩沖液。

（2）將樣品和蛋白Marker100℃水浴5min，冷卻到室溫后上樣緩慢加入。

7.5 跑電泳

（1）電泳槽里面加電泳液加到上樣孔，外面加1/3的電泳液。

（2）電壓80V，等藍色條帶進入分離膠后調(diào)到120V。

（3）待條帶距離分離膠底部1cm處停止電泳。

7.6 切膠

將濃縮膠全部切除，為了分辨正反在將分離膠的右下角切去。

7.7 染色和脫色

（1）將膠體放入染色液中，染色液要充分覆蓋膠體，置于搖床上緩慢搖晃1h。

（2）倒出染色液，倒入脫色液，置于搖床上緩慢搖晃，室溫脫色4～24h，期間更換脫色液2～4次，直到看清條帶。（圖1）

8 討論

（1）1號樣品到4號樣品為上清，5號樣品到8號樣品為細菌 沉淀，5號樣品未加IPTG，6號樣品為加IPTG后2h，7號樣品為加入后3h，8號樣品為加入后4h

（2）根據(jù)條帶可看出，1號樣品至4號樣品上清是沒有條帶的，5號樣品只至8號樣品細菌沉淀出現(xiàn)條帶，7號和8號樣品的目的條帶較明顯，因此暫定加入IPTG后3h為最佳誘導時間，并進行第二次實驗。（圖2）

9 實驗結(jié)果

五個樣本均出現(xiàn)了較為清晰目的條帶，實驗成功，可進行下一步工作，優(yōu)化蛋白表達，純化目的蛋白。

圖1

圖2