萬(wàn)屹東，高有軍，馬江鋒

(1.常茂生物化學(xué)工程股份有限公司，江蘇 常州 213034；2.江蘇省生化手性工程技術(shù)研究中心，江蘇 常州 213034；3.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

丁二酸作為重要的C4平臺(tái)化合物擁有巨大的市場(chǎng)需求，可作為鮮味劑、食品鐵質(zhì)強(qiáng)化劑、分析試劑、配制電鍍藥水、清洗添加劑等應(yīng)用于食品工業(yè)與化學(xué)工業(yè)，同時(shí)可作為聚合單體合成生物可降解材料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)和耐高溫特殊尼龍(PA-X4)[1]。此外，基于丁二酸線性的分子結(jié)構(gòu)和二元羧酸特性，可作為前體進(jìn)一步合成多個(gè)大宗化學(xué)品，如1,4-丁二醇(聚酯纖維和氨綸的單體)、γ-丁內(nèi)酯(農(nóng)藥、除草劑和部分藥物的前體)、四氫呋喃(聚四亞甲基醚二醇合成的前體和助劑)、己二酸(尼龍PA-X6的單體)和N-甲基吡咯烷酮(化工和鋰電池工業(yè)中的重要溶劑)，預(yù)計(jì)至2020年市場(chǎng)需求將達(dá)到70萬(wàn)t[2]。

目前丁二酸的生產(chǎn)主要以丁烷為原料，通過(guò)催化加氫等步驟進(jìn)行化學(xué)合成，其生產(chǎn)工藝成熟，較生物基丁二酸的制備具有顯著成本優(yōu)勢(shì)，但其依賴原油，因此成本受原油價(jià)格波動(dòng)影響較大、原料不可再生且生產(chǎn)過(guò)程污染嚴(yán)重[3]。在石油危機(jī)及環(huán)境污染的雙重壓力下，微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸因具有利用可再生資源、固定溫室氣體CO2等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。

美國(guó)能源部在20世紀(jì)90年代初提出了替代性原料計(jì)劃,并聯(lián)合了Argonne National Laboratory、OakRidge National Laboratory、Pacific Northwest National Laboratory和National Renewable Energy Laboratory(NREL)這4個(gè)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合進(jìn)行丁二酸生物轉(zhuǎn)化和提取技術(shù)的攻關(guān)。如今，已經(jīng)有多家企業(yè)建立了商業(yè)化的生物基丁二酸生產(chǎn)線，并開(kāi)始對(duì)外提供生物基丁二酸樣品供下游產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)以滿足丁二酸的市場(chǎng)需求。荷蘭DSM和法國(guó)Roquette兩家公司聯(lián)合成立的Reverdia公司于2014年對(duì)外聲明在意大利建立了采用酵母菌低pH發(fā)酵的10 000噸/年生產(chǎn)能力的商業(yè)化生物基丁二酸裝置(http://www.reverdia.com/news-events/news/)。美國(guó)BioAmber公司于2015年聲明其合資公司 Sarnia和日本三井公司合作，建成了基于低pH發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)和建設(shè)的30 000噸/年生物基丁二酸生產(chǎn)裝置(https://www.bio-amber.com/bioamber/en/company)。除此之外，美國(guó)Myriant也建立了采用銨鹽法中性發(fā)酵工藝的14 000噸/年的生物基丁二酸裝置(http://www.myriant.com/)。荷蘭CorbionPurac和德國(guó)BASF聯(lián)合成立的Succinity公司在西班牙建立了采用中性發(fā)酵工藝的14 000噸/年的生物基丁二酸裝置(http://www.succinity.com/about-us)。國(guó)內(nèi)中國(guó)石化揚(yáng)子石油化工股份有限公司與南京工業(yè)大學(xué)合作，設(shè)計(jì)和建造了采用鈉鹽法中性發(fā)酵的1 000噸/年生物基丁二酸中試生產(chǎn)裝置。

生物基丁二酸已經(jīng)初步實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，但與生物基富馬酸、蘋(píng)果酸等生物煉制有機(jī)酸產(chǎn)品一樣，其主要問(wèn)題是比化學(xué)合成的制造成本要高。檸檬酸的生物制造是目前有機(jī)酸生物煉制中最成功的案例之一。20世紀(jì)末我國(guó)天津工業(yè)微生物所、上海工業(yè)微生物所以及企業(yè)家的聯(lián)合攻關(guān)，在菌株、發(fā)酵過(guò)程及放大過(guò)程三方面取得了重大成果，目前檸檬酸發(fā)酵技術(shù)(檸檬酸的平均生產(chǎn)質(zhì)量濃度、生產(chǎn)速率和總收率分別約為150 g/L、3 g/(L·h)和90%，車間成本在4 000元/噸左右)處于世界領(lǐng)先水平[4]。中國(guó)有檸檬酸生產(chǎn)廠近百家，總年產(chǎn)能力約100萬(wàn)t，是全球最大的檸檬酸生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，如安徽豐原生化公司的檸檬酸生產(chǎn)能力達(dá)18萬(wàn)t，占世界檸檬酸生產(chǎn)額的17%，居世界第一位[4-5]。因此，利用先進(jìn)的合成生物學(xué)、代謝工程等技術(shù)，結(jié)合分離工藝模擬、設(shè)計(jì)及優(yōu)化，提高丁二酸的生產(chǎn)效率，將有助于實(shí)現(xiàn)生物基丁二酸的低成本制造，具備與石油基丁二酸相競(jìng)爭(zhēng)的成本優(yōu)勢(shì)[6]。

本文中，筆者針對(duì)國(guó)內(nèi)外生物基丁二酸生產(chǎn)成本偏高以及產(chǎn)品原料依賴糧食資源等問(wèn)題，從生產(chǎn)菌株、非糧碳源、發(fā)酵工藝和分離工藝四方面進(jìn)行綜述，并預(yù)測(cè)未來(lái)具有經(jīng)濟(jì)性的工藝路線，為生物基丁二酸的綠色、高效和低成本制造提供借鑒。

1 丁二酸生產(chǎn)菌株

1.1 野生菌株

產(chǎn)丁二酸野生菌株主要包括產(chǎn)琥珀酸放線桿菌[7]、曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌[8]、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌[9]和鈍齒棒桿菌[10]等(表1)。丁二酸是三羧酸途徑(TCA)的終端產(chǎn)物之一，其合成途徑如圖1所示，因此在厭氧條件下諸多野生型菌株也能積累丁二酸。

1—Embden-Meyerhof途徑；2—丙酮酸激酶；3—磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；4—丙酮酸羧化酶；5—丙酮酸脫氫酶；6—檸檬樹(shù)合成酶；7—蘋(píng)果酸脫氫酶；8—富馬酸酶；9—富馬酸還原酶；10—順烏頭酸酶；11—異檸檬酸裂解酶；12—異檸檬樹(shù)裂解酶；13—蘋(píng)果酸合酶；14—乳酸脫氫酶；15—丙酮酸裂解酶；16—磷酸轉(zhuǎn)乙酰化酶和乙酸激酶；17—乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶

表1 產(chǎn)丁二酸野生菌株

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌最先是從牛瘤胃內(nèi)容物中分離得到的一種兼性厭氧、不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性桿菌，該菌在厭氧環(huán)境中可以利用廣泛的碳源，如葡萄糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖和其他還原性糖[18]。研究人員考察了該菌對(duì)一些廢棄生物質(zhì)的利用情況，如乳清[12]、甘蔗糖蜜[14]、稻草[15]、玉米芯[11,16]、秸稈[13]、麩皮[19]和浮萍[20]等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌具有利用多種生物質(zhì)的天然特性，在低劣生物質(zhì)綜合利用方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，能夠通過(guò)菌株原料預(yù)處理、發(fā)酵過(guò)程控制等策略實(shí)現(xiàn)全糖利用。

曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌是從牛的瘤胃中分離篩選得到的另一株兼性厭氧嗜CO2革蘭氏陰性菌。以葡萄糖為碳源，厭氧發(fā)酵時(shí)丁二酸是主要產(chǎn)物，乙酸和甲酸為主要副產(chǎn)物，比例為2∶ 1∶ 1。此外，利用乳清為底物，以玉米浸出物代替酵母提取物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，收率71%，生產(chǎn)速率達(dá)到1.18 g/(L·h)[8]。

產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌是從小獵犬的口腔中分離得到的一株革蘭氏陰性、嚴(yán)格厭氧菌，以葡萄糖為碳源厭氧發(fā)酵時(shí)，主產(chǎn)物為丁二酸和乙酸，同時(shí)生成少量的甲酸、乙醇和乳酸[21]。但產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌不能耐受高滲透壓，最優(yōu)底物葡萄糖為20～80 g/L，而且不能耐受高濃度的丁二酸鹽。因此，Meynial-Salles等[9]通過(guò)耦合電滲析過(guò)程并結(jié)合膜生物反應(yīng)器，產(chǎn)物丁二酸產(chǎn)量提高至83 g/L，且收率和生產(chǎn)速率分別達(dá)到1.35 mol/mol和10.4 g/(L·h)，具有一定的應(yīng)用前景。

鈍齒棒桿菌是一株產(chǎn)谷氨酸菌，Chen等[10]篩選得到一株鈍齒棒桿菌，該菌有氧發(fā)酵時(shí)能生產(chǎn)谷氨酸，回收細(xì)胞轉(zhuǎn)厭氧發(fā)酵能夠利用合成培養(yǎng)基發(fā)酵制備丁二酸，且細(xì)胞能夠重復(fù)回收利用多次。當(dāng)以麥麩水解液為碳源發(fā)酵時(shí)，丁二酸產(chǎn)量和生產(chǎn)速率分別達(dá)到43.6 g/L和4.36 g/(L·h)。

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌和曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌等野生菌株能夠高收率、高濃度制備丁二酸，但這類菌多為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，往往依賴營(yíng)養(yǎng)豐富的復(fù)合培養(yǎng)基，而高昂的培養(yǎng)基成本使得這類菌株的經(jīng)濟(jì)性大大降低。

1.2 基因工程菌株

隨著基因測(cè)序、基因編輯技術(shù)及基因精細(xì)調(diào)控表達(dá)等技術(shù)的進(jìn)步，從分子層面改造微生物代謝網(wǎng)絡(luò)提高丁二酸生產(chǎn)效率的研究已經(jīng)取得了一定的成果(表2)。綜合各種代謝工程改造策略，丁二酸基因工程菌的構(gòu)建主要包括：敲除或突變副產(chǎn)物合成途徑相關(guān)基因、外源引入或超量表達(dá)丁二酸合成途徑相關(guān)酶、提高底物利用效率及優(yōu)化輔因子代謝。

表2 產(chǎn)丁二酸代謝工程菌株

1.2.1 敲除或突變副產(chǎn)物合成途徑相關(guān)基因

為超量積累目標(biāo)產(chǎn)物，首先需要解決副產(chǎn)物積累的問(wèn)題，可以通過(guò)敲除或突變副產(chǎn)物合成途徑中關(guān)鍵酶基因來(lái)減少副產(chǎn)物的合成。在丁二酸基因工程菌株中，主要包括有氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵兩類生產(chǎn)菌。針對(duì)有氧丁二酸生產(chǎn)菌株，Lin等[28-29]通過(guò)失活大腸桿菌的sdhAB、poxB、ackA-pta、iclR和ptsG基因構(gòu)建獲得了重組菌E.coliHL27659k，該菌株發(fā)酵59 h積累58.3 g/L丁二酸，收率為0.56 g/g。Otero等[36]結(jié)合進(jìn)化代謝選育并敲除釀酒酵母SDH3P和Ser3p/Ser33p基因，維持細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝合成丁二酸的過(guò)程，最終產(chǎn)物濃度比出發(fā)菌株提高了43倍。Yuzbashev等[33]敲除解脂耶氏酵母SUC2和SDH2基因并突變了SDH1基因，獲得的重組菌在低pH下以甘油為碳源發(fā)酵制備丁二酸，產(chǎn)量達(dá)到45 g/L，該技術(shù)具有顯著減少下游分離步驟的作用。針對(duì)厭氧丁二酸生產(chǎn)菌株，敲除ldhA、pflB、adh以及pta、ackA、poxB基因可以減少乳酸、甲酸、乙醇和乙酸的積累，而失活磷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(PTS)中的葡萄糖專性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因ptsG可以減少丙酮酸的生成，促使更多的碳代謝流流向還原三羧酸途徑。其中，重組大腸桿菌KJ073(ldhA、adhE、ackA、focA-pB、mgsA、poxB)利用合成培養(yǎng)基，以葡萄糖為碳源厭氧發(fā)酵，丁二酸的收率達(dá)到1.2 mol/mol[37]。Lee等[35]敲除曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌中的ldhA、pflB、pta和ackA基因構(gòu)建獲得了重組菌M.succiniciproducensLPK7，該菌株在分批發(fā)酵過(guò)程中積累52.4 g/L丁二酸，收率為1.16 mol/mol，生產(chǎn)速率達(dá)到1.8 g/(L·h)。

1.2.2 外源引入或超量表達(dá)丁二酸合成途徑相關(guān)酶

在敲除或突變與副產(chǎn)物合成相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步強(qiáng)化丁二酸合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)是提高丁二酸合成效率的另一種策略。Wang等[38]通過(guò)敲除大腸桿菌中l(wèi)dhA、pflB和ptsG基因并過(guò)量表達(dá)來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌的ppc基因獲得重組菌株SD121，該菌株利用秸稈水解液厭氧發(fā)酵，丁二酸達(dá)到36.5 g/L，收率為0.83 g/g。另一方面，若在ppc基因缺失的菌株中超量表達(dá)pck基因，使得催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)至草酰乙酸的反應(yīng)能額外產(chǎn)生一分子ATP，可促進(jìn)菌株在厭氧條件下的生長(zhǎng)性能，進(jìn)而提高丁二酸的生產(chǎn)效率[37]。Yang等[39]基于提高菌株產(chǎn)物合成速率的計(jì)算機(jī)模擬方法，在有氧丁二酸生產(chǎn)菌E.coliZJG13中超量表達(dá)pyc基因，結(jié)果表明重組菌E.coliZJG13/pT184pyc的平均生產(chǎn)速率比丁二酸的明顯提高。Okino等[30]敲除了谷氨酸棒桿菌的ldhA基因并表達(dá)pyc基因，重組菌所產(chǎn)的丁二酸達(dá)到146 g/L，厭氧階段收率0.92 g/g。在嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)中采用相同的策略也實(shí)現(xiàn)丁二酸的超量積累，丁二酸超過(guò)100 g/L，收率為1.34 mol/mol[31]。Yan等[32]在缺失pdc、fum1基因的釀酒酵母中過(guò)量表達(dá)pyc2和mdh3r基因并引入來(lái)源于大腸桿菌的fumC、frds1基因，構(gòu)建獲得的重組釀酒酵母在pH3.8的酸性環(huán)境下發(fā)酵也能積累12.9 g/L丁二酸。

1.2.3 提高底物利用效率

在野生型大腸桿菌中，葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化主要采用PTS系統(tǒng)完成，該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)每轉(zhuǎn)運(yùn)1分子葡萄糖需要消耗1分子磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)[40]。PEP是厭氧丁二酸合成過(guò)程中重要的前體物質(zhì)，為了提高還原三羧酸途徑中PEP的供給，Lu等[41]失活了PTS系統(tǒng)使得葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)采用激酶途徑，結(jié)果導(dǎo)致葡萄糖代謝速率顯著下降，進(jìn)一步構(gòu)建啟動(dòng)子和mRNA穩(wěn)定區(qū)文庫(kù)精細(xì)調(diào)控半乳糖透性酶和葡萄糖激酶基因的表達(dá)，使得葡萄糖消耗速率達(dá)到1.64 g/(L·h)，代謝速率提高了10倍。

木糖是纖維素水解液的主要成分之一，來(lái)源廣泛，可作為微生物發(fā)酵的重要碳源。Liu等[42]研究發(fā)現(xiàn)，野生型大腸桿菌可以利用木糖進(jìn)行厭氧有機(jī)酸發(fā)酵，但當(dāng)敲除乳酸和甲酸、乙酸生成相關(guān)的編碼基因pflB和ldhA后，菌株在厭氧條件下不能利用木糖生長(zhǎng)和代謝。進(jìn)一步通過(guò)敲除自身ppc基因并引入來(lái)源于枯草芽孢桿菌的pck基因，提高了胞內(nèi)ATP的供給，從而恢復(fù)了菌株的木糖利用能力。在以秸稈水解液為碳源的發(fā)酵過(guò)程中，丁二酸的收率達(dá)到1.02 g/g，該研究證實(shí)了木糖代謝較葡萄糖代謝需要更多的ATP供給，供給不足將導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)及代謝受到抑制。

除單糖外，二糖、多糖等也可作為丁二酸發(fā)酵的碳源。Inokuma等[43]和Park等[44]研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建細(xì)胞表面展示系統(tǒng)將相關(guān)的水解酶固定在細(xì)胞表面，促使二糖、多糖在胞外水解并獲得單糖，進(jìn)而可作為細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝所需的碳源。Ma等[45]利用細(xì)胞表面展示技術(shù)以產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌AFP111為出發(fā)菌株，以O(shè)mpC為錨定蛋白將蔗糖水解蛋白錨定在細(xì)胞表面，最終菌株能夠利用蔗糖發(fā)酵制備丁二酸。當(dāng)以蔗糖和糖蜜為碳源時(shí)，發(fā)酵34 h時(shí)丁二酸的質(zhì)量濃度分別達(dá)到41和36.3 g/L。

1.2.4 優(yōu)化輔因子代謝

微生物胞內(nèi)存在氧化還原平衡，其分子基礎(chǔ)是NAD(P)+和NAD(P)H等輔因子對(duì)的比例。當(dāng)對(duì)微生物胞內(nèi)代謝途徑進(jìn)行重構(gòu)后，往往會(huì)引起輔因子比例的變化，影響菌株生長(zhǎng)及代謝。Vemuri等[46]敲除了大腸桿菌ldhA和pflB基因獲得E.coliNZN111，該菌株由于降低了NAD+的再生效率，導(dǎo)致胞內(nèi)輔因子失衡，因此在厭氧條件下不能以葡萄糖為碳源生長(zhǎng)。針對(duì)NZN111生長(zhǎng)抑制的問(wèn)題，Liang等[47-49]先后采用兩種策略恢復(fù)了其生長(zhǎng)及代謝能力，一是通過(guò)mdh基因的超量表達(dá)強(qiáng)化NADH的消耗速率，二是從NAD+原始生物合成途徑出發(fā)提高NAD+的總量使之不容易失衡。Zhou等[50]在枯草芽孢桿菌中引入來(lái)源于大腸桿菌的pntAB基因，其表達(dá)的酶能夠催化NAD(H)和NADP(H)相互轉(zhuǎn)化，以維持胞內(nèi)輔因子的平衡，最終該重組枯草芽孢桿菌丁二酸收率和質(zhì)量濃度分別提高了16%和57%。

2 底物碳源

2.1 主要非糧生物質(zhì)碳源

淀粉質(zhì)碳源是目前生物基丁二酸發(fā)酵的主要碳源，但在“不與民爭(zhēng)糧，不與民爭(zhēng)地”的方針原則下，開(kāi)發(fā)其他低成本碳源迫在眉睫。根據(jù)揚(yáng)子石油化工股份有限公司“1 000噸/年丁二酸中試生產(chǎn)裝置”連續(xù)3批發(fā)酵數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未公布)結(jié)果分析，碳源約占丁二酸生產(chǎn)成本的45%～50%。因此，如何降低碳源成本是建立經(jīng)濟(jì)性的丁二酸生產(chǎn)工藝需要重點(diǎn)考慮的問(wèn)題之一?；诖?，眾多研究者考察了諸如纖維素水解液等低品位碳源在丁二酸發(fā)酵體系中的利用情況。

Chen等[51]通過(guò)營(yíng)養(yǎng)定向補(bǔ)給策略，采用廢酵母細(xì)胞水解液和玉米秸稈水解液復(fù)配的方法，A.succinogenesNJ113能積累70.3 g/L丁二酸，收率和生產(chǎn)速率達(dá)到67.7%和0.63 g/(L·h)。Liu等[42]以蔗渣水解液為原料，利用重組大腸桿菌BA204兩階段發(fā)酵，厭氧階段丁二酸收率達(dá)到0.96 g/g。連續(xù)糖化發(fā)酵可減少預(yù)處理步驟，Zheng等[52]和Chen等[53]分別考察了A.succinogenes和E.coli連續(xù)糖化發(fā)酵制備丁二酸的可能性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在發(fā)酵介質(zhì)中添加纖維素酶和纖維二糖酶可以利用經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單稀酸處理的纖維素物質(zhì)，最高的丁二酸質(zhì)量濃度達(dá)到47.7 g/L。

盡管水解秸稈等木質(zhì)纖維素原料用于發(fā)酵制備丁二酸具有環(huán)境友好、來(lái)源廣泛以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但現(xiàn)有的半纖維素水解技術(shù)往往導(dǎo)致水解液中含有糠醛、羥甲基糠醛和甲酸等抑制物，若不經(jīng)過(guò)脫毒處理，這類物質(zhì)將在發(fā)酵過(guò)程中影響微生物的生長(zhǎng)及代謝，并影響最終丁二酸產(chǎn)品品質(zhì)[54-55]。為了提高菌株的發(fā)酵效率，Wang等[56]在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)糠醛降解基因獲得重組菌E.coliXW36，該菌株能利用未脫毒半纖維素水解液發(fā)酵制備丁二酸，產(chǎn)物質(zhì)量濃度和收率達(dá)到32 g/L和0.9 g/g。

2.2 氣態(tài)碳源——CO2氣體

除了過(guò)程中采用碳酸鹽外，在發(fā)酵初始需要大量的CO2氣體以使得發(fā)酵環(huán)境成為厭氧環(huán)境，因此厭氧發(fā)酵丁二酸工業(yè)生產(chǎn)必須具備直接的CO2氣體供應(yīng)能力。而采用純CO2壓縮氣體成本較高，如果能與企業(yè)現(xiàn)有的排放CO2氣體的生產(chǎn)裝置(如環(huán)氧乙烷裝置、生物乙醇裝置、甲烷裝置等)耦合或是進(jìn)行過(guò)境處理，不僅能降低溫室氣體的排放，也能解決厭氧丁二酸發(fā)酵氣態(tài)碳源的問(wèn)題。Wu等[58]考察了環(huán)氧乙烷尾氣(環(huán)氧乙烷裝置實(shí)際的尾氣中含氧量在1.2%以內(nèi))為CO2氣態(tài)碳源厭氧發(fā)酵制備丁二酸的可行性，結(jié)果丁二酸終質(zhì)量濃度為68.1 g/L，CO2氣體固定速率達(dá)到4.7 mmol/(L·h)，基本與純CO2氣體發(fā)酵性能基本一致，且環(huán)氧乙烷尾氣含氧量在2%范圍以內(nèi)波動(dòng)對(duì)發(fā)酵無(wú)影響。

3 丁二酸生產(chǎn)工藝

3.1 發(fā)酵工藝

針對(duì)生物基丁二酸的發(fā)酵工藝已經(jīng)有大量的研究成果，除了常見(jiàn)的分批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵[59]策略外，研究者還設(shè)計(jì)并形成了細(xì)胞循環(huán)利用技術(shù)、分階段連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)以及基于膜技術(shù)的發(fā)酵分離耦合工藝等[60-62]。Beauprez等[63]總結(jié)了現(xiàn)有的眾多的發(fā)酵策略，在肯定了這些策略的優(yōu)點(diǎn)之余，也提出了存在的問(wèn)題。眾所周知，丁二酸是大宗化學(xué)品，價(jià)格偏低，對(duì)生產(chǎn)成本控制要求高，因此需要進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，比較合理的發(fā)酵體積在100 m3左右?；诖?，很多復(fù)雜的發(fā)酵策略因其投資和操作成本高、維護(hù)困難以及運(yùn)轉(zhuǎn)穩(wěn)定性偏差等問(wèn)題很難實(shí)施。比如，利用超濾膜進(jìn)行細(xì)胞循環(huán)利用在大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中就存在易導(dǎo)致染菌、膜易被堵塞等問(wèn)題[64]。因此，在諸如丁二酸這類大宗化學(xué)品的發(fā)酵策略的選擇上必須考慮其對(duì)生產(chǎn)成本的影響以及在實(shí)際生產(chǎn)中的操作難度。

3.2 產(chǎn)品分離工藝

3.2.1 傳統(tǒng)有機(jī)酸分離工藝-鈣鹽法

傳統(tǒng)的有機(jī)酸工業(yè)化生產(chǎn)，如檸檬酸、乳酸、衣康酸均采用鈣鹽法[5,65-66]。該技術(shù)成熟，且生產(chǎn)成本低，但會(huì)產(chǎn)生大量的硫酸鈣沉淀(即石膏)，大量固廢的產(chǎn)生對(duì)環(huán)境影響較大。同時(shí)，該技術(shù)只適合低pH(pH<5)發(fā)酵，對(duì)于中性發(fā)酵工藝，鈣鹽法缺點(diǎn)很多，如必須額外添加酸中和劑。

3.2.2 銨鹽法

銨鹽法是指在發(fā)酵過(guò)程中采用氨水調(diào)節(jié)pH并形成丁二酸二銨，在分離階段經(jīng)固液分離后采用硫酸或硫酸氫銨酸化生成丁二酸和硫酸銨并進(jìn)化后續(xù)的純化步驟。其中丁二酸可通過(guò)濃縮、結(jié)晶沉淀進(jìn)行純化，剩余的母液主要含有硫酸銨和約7%的丁二酸，該母液可直接作為化肥銷售，也可采用熱裂解的方法重新生成氨氣和硫酸氫銨[67-68]。

該技術(shù)較鈣鹽法的優(yōu)勢(shì)是采用廉價(jià)的氨水為原料，且可利用循環(huán)閉合工藝回收氨氣，同時(shí)產(chǎn)生的母液是含部分丁二酸的硫酸銨溶液，可直接作為化肥銷售。其缺點(diǎn)是采用氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程pH值，對(duì)微生物的發(fā)酵產(chǎn)生了一定的抑制作用[69]，未來(lái)需要在菌株構(gòu)建和馴化過(guò)程中提高其對(duì)銨鹽的耐受性能和利用能力。同時(shí)，母液中損失的丁二酸降低了整個(gè)產(chǎn)品的分離收率。

3.2.3 電滲析法

電滲析法是指在發(fā)酵過(guò)程中采用NaOH作為酸中和劑形成丁二酸二鈉，進(jìn)而采用電滲析膜一步實(shí)現(xiàn)固液分離和濃縮丁二酸二鈉[70]。Dunuwilla等[71]在丁二酸體系中采用雙極膜電滲析，借助電勢(shì)的作用分離獲得丁二酸和NaOH。

該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是發(fā)酵過(guò)程采用了廉價(jià)的NaOH作為酸中和劑，且該物質(zhì)能在下游分離過(guò)程中回收獲得，且整個(gè)過(guò)程不會(huì)產(chǎn)生大量的鹽。其缺點(diǎn)是鈉鹽對(duì)發(fā)酵過(guò)程同樣存在抑制，尤其是采用NaOH時(shí)。同時(shí)雙極膜電滲析的使用需要高昂的設(shè)備投資及相應(yīng)的自動(dòng)化裝備投入，雙極膜的壽命也是制約其普及的另一因素。

3.2.4 直接結(jié)晶工藝

與上述3種工藝不同，直接結(jié)晶工藝依賴低pH發(fā)酵過(guò)程，即在丁二酸整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中不調(diào)節(jié)pH，因此發(fā)酵液中存在大量游離的丁二酸。該方法的優(yōu)勢(shì)顯而易見(jiàn)，即簡(jiǎn)化了分離步驟，降低了下游設(shè)備投資，提高了分離收率。但該方法要求微生物具有較強(qiáng)的耐低pH性能，而提高細(xì)胞的耐受性能會(huì)消耗額外的能量[72]，因而導(dǎo)致產(chǎn)物收率的下降。因此，需要對(duì)丁二酸生產(chǎn)菌株進(jìn)行必要的基因工程改造并結(jié)合合適的胞外控制策略提高丁二酸的生產(chǎn)效率。

4 結(jié)論與展望

通過(guò)對(duì)現(xiàn)有丁二酸生產(chǎn)工藝與乳酸、酒精發(fā)酵工藝的比較，筆者認(rèn)為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸的主要技術(shù)屏障包括：①現(xiàn)有丁二酸生產(chǎn)菌株未具備較高的魯棒性，在厭氧條件下尤其是采用低品位生物質(zhì)時(shí)，其生長(zhǎng)及代謝性狀較差。②下游過(guò)程分離步驟較多及三廢排放偏高。③未考慮綜合性工藝系統(tǒng)和工業(yè)化裝備等問(wèn)題。

因此，建立經(jīng)濟(jì)性的丁二酸發(fā)酵工藝需要具備的要素包括：①提高生產(chǎn)速率?？梢詼p少發(fā)酵設(shè)備投資和發(fā)酵的運(yùn)行成本。如果要在經(jīng)濟(jì)性上有競(jìng)爭(zhēng)力，最小的生產(chǎn)速率應(yīng)達(dá)到2.5 g/(L·h)。②減少營(yíng)養(yǎng)需求。產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程要求在保證菌株生長(zhǎng)及代謝性能的基礎(chǔ)上，使用最少的營(yíng)養(yǎng)。像酵母膏、生物素這樣價(jià)格高的營(yíng)養(yǎng)成分應(yīng)當(dāng)除去。營(yíng)養(yǎng)需求應(yīng)限制像玉米浸膏或價(jià)格相當(dāng)?shù)某煞?。③提高最終的產(chǎn)物濃度。產(chǎn)品最終的發(fā)酵濃度是影響整個(gè)工藝生產(chǎn)成本的重要因素，尤其是下游分離過(guò)程的能耗，因此較高的最終產(chǎn)物濃度將減少分離和濃縮的成本。④提高菌株對(duì)低pH的耐受性。理想的情況是發(fā)酵在低pH下運(yùn)行，不需要任何的堿中和，否則發(fā)酵階段的中和過(guò)程及下游分離階段鹽轉(zhuǎn)換為游離酸的過(guò)程會(huì)大大增加生產(chǎn)成本。

預(yù)測(cè)兩條經(jīng)濟(jì)性較高的丁二酸合成路線：①極低pH發(fā)酵(pH<3)，發(fā)酵過(guò)程不中和，下游采用結(jié)晶工藝，該路線要求菌株具有較高的耐酸性能和在低pH環(huán)境下的代謝性能，同時(shí)生產(chǎn)設(shè)備也需要采用相應(yīng)耐腐蝕性能的材質(zhì)。②中性pH發(fā)酵(pH 6.5～7.5)，發(fā)酵過(guò)程氨水中和，下游采用銨鹽閉合循環(huán)工藝，該路線要求菌株具有耐高濃度銨根離子的性能。