顧 磊 ，廖 維 ，周建萍

（1.武警重慶市消防總隊醫(yī)院口腔科，重慶 401120； 2.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，重慶 400037； 3.重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，重慶 401147）

口腔癌是臨床常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因［1］，具有高發(fā)病率、高致死率的特點［2-3］，臨床多采用手術(shù)切除、放射線治療、化學治療、中藥治療等方式治療。中醫(yī)學認為，癌癥多由熱、毒、痰、瘀及體虛等因素誘發(fā)［4］，中藥以其療效確切、應(yīng)用廣泛、不良反應(yīng)小等優(yōu)點，受到臨床醫(yī)師和科研人員的廣泛關(guān)注［5］。白花蛇舌草Oldenlandia diffusa屬茜草科植物，為臨床治療癌癥的常用藥物之一［6］，廣泛用于治療結(jié)直腸癌［7］、白血?。?］、肝癌［9］、肺癌［10］、卵巢癌［11］、乳腺癌［12］等。TING 等［9］對臺灣地區(qū)中草藥處方頻度進行橫斷面分析發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草治療肝癌具有顯著療效。此外，白花蛇舌草具有抗增殖［13］、促凋亡［11，14-15］抗炎［16-17］、抗氧化［18］、抗血管生成［19］、調(diào)節(jié)免疫功能［16，20-23］等多種抗癌作用機制；其提取物可通過激活p53誘導(dǎo)細胞凋亡，從而抑制癌細胞的生長［13］，還可增強巨噬細胞功能，從而抑制小鼠腎癌細胞生長。鑒于白花蛇舌草在抗腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用及其良好的臨床療效，本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法整體、系統(tǒng)地闡述藥物、靶點和疾病間的關(guān)系［24-25］，直觀地呈現(xiàn)藥物靶點網(wǎng)絡(luò)［26］，探討了白花蛇舌草治療口腔癌的作用機制及其藥用價值，為白花蛇舌草治療口腔癌藥效機制的定位和產(chǎn)生協(xié)同作用的潛在蛋白靶點的確定提供新的研究方法。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集構(gòu)建

數(shù)據(jù)集收集：檢索 HIT（http：／／lifecenter.biosino.org／hit／）［27］、中藥綜合資源數(shù)據(jù)庫（TCMID，http：／／www.megabionet.org／tcmid ／）［28］數(shù)據(jù)庫，PubMed 數(shù)據(jù)庫（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ／）［29］和中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平合（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http：／／lsp.nwu.edu.cn ／）［30］，從生物醫(yī)學文獻中收集白花蛇舌草的化合物成分，構(gòu)建白花蛇舌草化合物數(shù)據(jù)集。

化合物篩選：根據(jù)毒藥物動力學（ADME）藥物篩選標準，口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性指數(shù)（DL）≥0.18，血腦屏障（BBB）＞ -0.3，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目（RBN）≤10，分子極性表面積（PSA）≤60，對化合物進行初篩，剔除重復(fù)出現(xiàn)的化合物成分。進一步運用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）查詢獲得化合物的化學結(jié)構(gòu)式［31］，基于化學結(jié)構(gòu)式，運用TargetNet數(shù)據(jù)庫（http：／／targetnet.scbdd.com）［32］，根據(jù)里賓斯基五規(guī)則對化合物的成藥性進行評分。

1.2 靶點預(yù)測

通過搜索TCMSP數(shù)據(jù)庫中白花蛇舌草化合物的名稱，獲得其對應(yīng)的靶蛋白信息；在基于當前化學基因組學數(shù)據(jù)構(gòu)建大量的QSAR模型來預(yù)測化合物靶點的TargetNet數(shù)據(jù)庫中檢索，并篩選 Prob≥0.9 的靶點［32］。運 用 Pharmmapper 數(shù) 據(jù) 庫 （http：／／lilab-ecust.edu.cn ／Pharmmapper／）［33］，通過反向藥效團映射方法識別小分子的潛在靶點。

1.3 靶點收集及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)建立

采用 DiseaseGene Network 數(shù)據(jù)庫（http：／／www.disgenet.org ／）［34］和 DrugBank 數(shù) 據(jù) 庫 （https：／／www.drugbank.ca ／）［35］，搜索與“Oral Cavity Carcinoma”相關(guān)的疾病靶點，采用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫（http：／／genemania.org ／）［36］建立與已獲取疾病靶點關(guān)聯(lián)性較強的靶點。基于收集的口腔癌相關(guān)靶點，采用STRING數(shù)據(jù)庫（https：／／string-db.org ／）［37］建立 PPI網(wǎng)絡(luò)，作為基因映射的背景網(wǎng)絡(luò)。

1.4 預(yù)測靶點的基因映射提取及PPI網(wǎng)絡(luò)建立

采用Cytoscape軟件將白花蛇舌草化合物的靶點映射在口腔癌疾病靶點的PPI背景網(wǎng)絡(luò)上，提取白花蛇舌草治療口腔癌的預(yù)測靶點，并將其在STRING數(shù)據(jù)庫建立PPI網(wǎng)絡(luò)［37］，進一步研究具有高置信度（＞ 0.7）的 PPI。

1.5 拓撲分析與富集分析

拓撲分析：采用Cytoscape軟件，對獲取的上述相關(guān)靶點，計算“Degree”“ClosenessCentrality”“Betweenness Centrality”3個拓撲性質(zhì)，選取3個指標均大于中位數(shù)的靶點［38］，篩選出具有拓撲重要性的Hub節(jié)點，將其定義為白花蛇舌草治療口腔癌的核心靶點。

富集分析：采用 DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：／／david.ncifcrf.gov ／）［39］對生物過程（BP）、細胞成分（CC），分子功能（MF）及作用通路進行富集分析。P＜0.05為白花蛇舌草治療口腔癌的相關(guān)作用通路；P＜0.01和FDR＜1為白花蛇舌草治療口腔癌的核心作用通路。

基于收集獲得的白花蛇舌草治療口腔癌的預(yù)測靶點，采用 KEGG 數(shù)據(jù)庫（http：／／www.kegg.jp ／）［40］搜索并建立核心通路的路線圖，標注通路內(nèi)的預(yù)測作用靶點。

1.6 “靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)建立

基于收集獲得的預(yù)測靶點及富集分析核心作用通路，采用Cytoscape軟件建立白花蛇舌草治療口腔癌的“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)集構(gòu)建及靶點預(yù)測

通過 HIT，TCMID，PubMed，TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共獲得93種白花蛇舌草化學成分，根據(jù)ADME藥物篩選標準及里賓斯基五規(guī)則，共篩選出32種具有良好成藥性的化學成分?；诖?，采用3種方法預(yù)測白花蛇舌草的靶點信息，獲得1 468個靶點信息，刪除不同化合物間的重復(fù)靶點，共獲得353個白花蛇舌草的預(yù)測靶點。

2.2 口腔癌疾病相關(guān)靶點及PPI網(wǎng)絡(luò)的建立

檢索DiseaseGene Network和DrugBank數(shù)據(jù)庫，共收集獲得281個口腔癌的預(yù)測靶點，采用STRING數(shù)據(jù)庫建立口腔癌的PPI網(wǎng)絡(luò)，獲得1個具有281個節(jié)點、4 096條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)。詳見圖1。

2.3 基因映射結(jié)果與拓撲分析結(jié)果

基因映射：采用Cytoscape軟件，將353個白花蛇舌草預(yù)測靶點映射在以口腔癌PPI網(wǎng)絡(luò)為背景的網(wǎng)絡(luò)上，共獲得200個預(yù)測靶點，占口腔癌疾病靶點的71.17% 。詳見圖 2。

拓撲分析：白花蛇舌草治療口腔癌的200個預(yù)測靶點中，“Degree”中位數(shù)為 23，“Closeness Centrality”中位數(shù)為 0.476 534 985，“Betweenness Centrality”中位數(shù)為0.002 067 075，其中，“Degree”“Closeness Centrality”“Betweenness Centrality均大于中位數(shù)，且具有重要拓撲意義的節(jié)點共75個，即為Hub節(jié)點，為白花蛇舌草治療口腔癌的核心靶點。

圖1 口腔癌281個靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 基因映射提取白花蛇舌草治療口腔癌的預(yù)測靶點

2.4 預(yù)測靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)建立、富集分析結(jié)果及“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)建立

基于已獲得的200個白花蛇舌草治療口腔癌的預(yù)測靶點信息，建立PPI網(wǎng)絡(luò)，得1個具有200個節(jié)點、2 604條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇高置信度PPI，得1個具有200個節(jié)點、1 204條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，詳見圖3。對預(yù)測靶點信息進行富集分析，P＜0.05時包括336個 BP、38個 CC、105個 MF、25條相關(guān)作用通路，P＜0.01及FDR ＜0.01時包括 51個 BP、7個 CC、31個 MF、4條核心作用通路?；诖?，構(gòu)建白花蛇舌草治療口腔癌的“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖4?；谠贙EGG建立的4個核心作用通路的可視化通路網(wǎng)絡(luò)圖，建立白花蛇舌草治療口腔癌的可視化通路網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖5。

圖3 白花蛇舌草治療口腔癌的預(yù)測靶點高置信度PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 白花蛇舌草治療口腔癌“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究中，根據(jù)里賓斯基五規(guī)則和ADME參數(shù)［30，32］篩選出白花蛇舌草中32種具有良好成藥性的不同化合物成分，根據(jù)這些化合物成分，采用TCMSP，TargetNet，Pharmmapper數(shù)據(jù)庫檢索，收集到353個白花蛇舌草靶點，結(jié)合在DiseaseGene Network及DrugBank數(shù)據(jù)庫收集的281個口腔癌相關(guān)靶點，通過基因映射獲得了白花蛇舌草治療口腔癌的200個預(yù)測靶點，由此建立了一個具有200個節(jié)點、1 204條邊的高置信度PPI網(wǎng)絡(luò)，通過拓撲分析，獲得了白花蛇舌草治療口腔癌的75個核心靶點。

富集分析結(jié)果顯示，白花蛇舌草治療口腔癌主要作用于胞漿、核質(zhì)、細胞器膜、質(zhì)膜、細胞核等7個細胞成分，涉及了包括凋亡、增殖、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等51個生物過程及31個分子功能，這與已有的體內(nèi)外實驗研究結(jié)果一致［13-16］，其還參與如類固醇、單萜類、雜環(huán)類等多種物質(zhì)的生物代謝過程，這些代謝過程也一定程度上促進了白花蛇舌草的抗癌作用，LIEW等［41］研究發(fā)現(xiàn)，單萜吲哚生物堿具有顯著的細胞生長抑制作用，且對癌細胞具有靶向選擇性。通路富集分析結(jié)果表明，HIF-1 signaling pathway，Prolactin signaling pathway，Estrogen signaling pathway，TNF signaling pathway為核心作用通路。HIF-1 signaling pathway可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激及細胞周期等發(fā)揮抗癌作用。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1通路的激活可誘導(dǎo)癌細胞線粒體解偶聯(lián)從而發(fā)揮抗癌作用，核心靶點HIF-1被認為具有廣泛前景的抗腫瘤藥物靶點［42］。ALBADARI等［43］研究認為，HIF-1／2抑制劑及HIFs調(diào)節(jié)的廣泛復(fù)雜性有利于開發(fā)更精確的抗癌治療方法。Prolactin signaling pathway及Estrogen signaling pathway被認為是參與乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的經(jīng)典作用通路［44-45］。YAMAGUCHI等［46］研究發(fā)現(xiàn)，阻斷 Estrogen signaling pathway 可顯著降低芳香化酶基因表達，從而抑制癌細胞的生長，這2條通路與 p53 signaling pathway，PI3K signaling pathway，MAPK signaling pathway等多條通路間存在復(fù)雜的交互作用，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［47-49］。TNF signaling pathway在腫瘤相關(guān)研究中一直是被關(guān)注的焦點，ROBAYE等［50］及TARTAGLIA等［51］研究發(fā)現(xiàn)，TNFR1可觸發(fā)腫瘤內(nèi)皮細胞凋亡機制。MONTFORT等［52］研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞中輸送高濃度的腫瘤壞死因子能顯著提高免疫治療效果，TNF signaling pathway不僅是與炎癥、凋亡密切相關(guān)的信號通路，與PI3K-Akt signaling pathway間的交叉作用還參與細胞周期調(diào)節(jié)［53］。WANG 等［54］研究發(fā)現(xiàn)，通過 TNF-α ／NF-κB 與 PI3K／AKT signaling pathway逆轉(zhuǎn)EMT可抑制癌細胞的侵襲與遷移。

圖5 白花蛇舌草治療口腔癌的可視化通路網(wǎng)絡(luò)圖

綜上所述，本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法建立了白花蛇舌草治療口腔癌的可視化“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖及作用機制圖，并明確了白花蛇舌草治療口腔癌的多通路、多靶點的作用機制，白花蛇舌草治療口腔癌藥效機制的定位和協(xié)同作用的潛在蛋白靶點與通路。