張 容，楊 芳，李益麟，李春花，梁 志，劉少瓊

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院肛腸科，湖南 衡陽(yáng) 421000）

中醫(yī)理論認(rèn)為，肛門手術(shù)損傷致局部氣血瘀滯，經(jīng)脈阻塞，不通則痛，創(chuàng)面失于濡養(yǎng)，則愈合慢［1］。復(fù)方芙蓉花葉膏為外用于肛腸病術(shù)后促進(jìn)傷口愈合的制劑［2］，抑菌作用明顯［3］。復(fù)方芙蓉花葉膏是由芙蓉花葉、黃柏、地榆炭、大黃組方，按 1.7 ∶1 ∶1 ∶1 的配比煉制而成，煉制過(guò)程較復(fù)雜。作為中藥復(fù)方制劑，因缺乏基礎(chǔ)研究和理論支持，其推廣應(yīng)用受到了限制。本研究中探討了復(fù)方芙蓉花葉不同提取物的體外抑菌作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)復(fù)方芙蓉花葉新藥提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與菌種

儀器：DF-101D型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，SZCL-2型數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器，YRE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；JA2003型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，精度為1 mg）；YXQ-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器、GZX-9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BDS60型電熱三用水箱（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）；UV-2800A型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯＜上海＞儀器有限公司）；SPX-70BⅢ型生化培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；BSW-850H型水平層流凈化工作臺(tái)（蘇州潔凈技術(shù)研究所）；350 μL石英微量比色皿；35 mm玻璃培養(yǎng)皿；250 mL索氏提取器。

試藥：地榆炭（湖南省衡東縣中藥飲片廠）；芙蓉花葉、黃柏、大黃均購(gòu)自湖南馨恒堂中藥科技有限公司，干燥，粉碎，備用；Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

菌種：大腸埃希菌Escherichia coli、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidemidis均由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 供試液制備

乙醇提取物制備：取混合藥材粉末（芙蓉花葉9.04g，黃柏 5.32 g，大黃 5.32 g，地榆炭 5.32 g）25 g，精密稱定，用濾紙裝好，置250 mL索氏提取器中。用8倍量70%乙醇在100℃左右油浴鍋中冷卻回流3 h，過(guò)濾，收集濾液，將濾渣用6倍量70%乙醇依法再提取2次，收集3次的混合濾液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，溫度控制在65℃，濃縮至50 mL時(shí)將濃縮液置電熱套中蒸發(fā)濃縮至糊狀，再放入干燥箱中干燥至恒重。以上操作重復(fù)多次。

乙酸乙酯萃取物制備：取乙醇提取物適量，溶于約100 mL蒸餾水中，制成混懸液，加入石油醚去除色素、油脂等雜質(zhì)，萃取多次，直至石油醚層透亮和顏色不再變化為止。移去石油醚層，留下水相加入1.5倍量的乙酸乙酯連續(xù)萃取多次，每次留下乙酸乙酯層，直至乙酸乙酯層不再變色為止。收集乙酸乙酯層，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮，溫度控制在55℃，蒸發(fā)至固體狀。取出，置干燥箱中，干燥至恒重。以上操作重復(fù)多次。

水提取物制備：取混合藥材粉末（芙蓉花葉9.04 g，黃柏 5.32 g，大黃 5.32 g，地榆炭 5.32 g）25 g，精密稱定，置500 mL燒瓶中，加8倍量蒸餾水，在溫度調(diào)至145℃左右的電熱套中回流煎煮3 h，過(guò)濾，收集濾液，常溫保存。回收濾渣，置于500 mL燒瓶中，加入6倍量蒸餾水，用酒精燈煎煮2 h，過(guò)濾，收集濾液，以上操作重復(fù)2遍。合并3次收集的濾液，置于燒杯中，置電熱套中蒸發(fā)濃縮，電熱套溫度調(diào)至100℃左右，濃縮呈膏狀，置干燥箱中，干燥至恒重。以上操作重復(fù)多次。

供試液制備：分別取適量乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物和水提取物，用0.9%氯化鈉溶液配制成質(zhì)量濃度為0.5 g／mL的提取物溶液，滅菌，備用。

1.2.2 MH 培養(yǎng)基制備

將MH瓊脂培養(yǎng)基與蒸餾水按42∶1 000的比例配制，121℃高壓滅菌20min，置50℃恒溫水浴箱中，備用。

1.2.3 菌液制備

取2只無(wú)菌培養(yǎng)皿，裝入融化的無(wú)菌培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，在無(wú)菌條件下將大腸埃希菌與表皮葡萄球菌用劃線法分別接種到不同培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基上。放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，置4℃冰箱中冷藏；取出活化好的菌種，在無(wú)菌環(huán)境下，用無(wú)菌接種環(huán)吸取適量大腸埃希菌，置裝有2 mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液的試管中，吸取適量，置比色皿中，采用分光光度計(jì)測(cè)細(xì)菌OD值法，配制大腸埃希菌和表皮葡萄球菌的濃度在107～108cfu／mL范圍內(nèi)。

1.2.4 抑菌試驗(yàn)

取11只直徑為3.5 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿，分別標(biāo)記為1～11號(hào)，用標(biāo)記筆將培養(yǎng)皿劃分為Ⅰ區(qū)（大腸埃希菌區(qū)域）和Ⅱ區(qū)（表皮葡萄球菌區(qū)域）。采用二倍稀釋法，往2～11號(hào)培養(yǎng)皿中加入1.5 mL滅菌0.9%氯化鈉溶液，往1號(hào)培養(yǎng)皿中加入1.5 mL藥物質(zhì)量濃度為0.5 g／mL的乙醇提取物，往2號(hào)培養(yǎng)皿中加入1.5 mL藥物質(zhì)量濃度為0.5 g／mL的乙醇提取物，充分混勻，再?gòu)?號(hào)培養(yǎng)皿中吸取1.5 mL混合液加入3號(hào)培養(yǎng)皿，充分混勻，再?gòu)?號(hào)培養(yǎng)皿中吸取1.5 mL混合液加入4號(hào)培養(yǎng)皿，依法直至加入至9號(hào)培養(yǎng)皿，再?gòu)?號(hào)培養(yǎng)皿中棄去1.5 mL混合液。最后往1～9號(hào)培養(yǎng)皿中均加入4 mL無(wú)菌水解酪蛋白瓊脂（MHA）培養(yǎng)基，迅速混勻，冷卻凝固，制成藥物質(zhì)量濃度分別為 136.36，68.18，34.09，17.05，8.52，4.26，2.13，1.07，0.53 g ／L 的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。第10號(hào)培養(yǎng)皿僅加入4 mL無(wú)菌MHA培養(yǎng)基，作為陰性對(duì)照。用無(wú)菌接種環(huán)通過(guò)劃線法分別接種大腸埃希菌及表皮葡萄球菌于1～10號(hào)培養(yǎng)皿相對(duì)應(yīng)區(qū)域。第11號(hào)培養(yǎng)皿不加提取藥物且不接種細(xì)菌，作為空白對(duì)照。再將11只培養(yǎng)皿一同放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。以上操作均嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則。同法操作乙酸乙酯萃取物及水提取物，且每種提取物對(duì)2種細(xì)菌分別做3次重復(fù)試驗(yàn)。觀察不同提取物及其不同藥物質(zhì)量濃度對(duì)大腸埃希菌及表皮葡萄球菌的抑制作用，并記錄最低抑菌濃度（MIC）值，即在體外培養(yǎng)細(xì)菌18～24 h后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌生長(zhǎng)的最低藥物質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果

2.1 藥物提取率

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3種提取方法的藥物提取率比較

2.2 對(duì)大腸埃希菌及表皮葡萄球菌的體外抑菌效果

3種方法的提取物均能對(duì)大腸埃希菌和表皮葡萄球菌產(chǎn)生較明顯的抑菌效果，詳見(jiàn)表2。其中，陰性對(duì)照組有大腸埃希菌及表皮葡萄球菌生長(zhǎng)，空白對(duì)照組無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，且3次重復(fù)抑菌試驗(yàn)結(jié)果一致。乙醇、乙酸乙酯及水提取方案對(duì)大腸埃希菌的MIC分別為68.18，4.26，68.18 g／L；對(duì)表皮葡萄球菌的MIC分別為34.09，1.07，4.26 g ／L?？梢?jiàn)，乙酸乙酯萃取提取的復(fù)方芙蓉花葉提取物的抑菌作用最強(qiáng)，詳見(jiàn)表3。

3 討論

復(fù)方芙蓉花葉是一種外用于促進(jìn)肛腸疾病術(shù)后傷口愈合的制劑，其為芙蓉花葉、黃柏、地榆炭和大黃配伍而成。芙蓉花葉味辛，性平，無(wú)毒，具有涼血、解毒、消腫、止痛等功效［4-5］，且芙蓉花和葉均具有抗菌作用［6］。黃柏味苦，性寒，具有清熱解毒之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、鎮(zhèn)咳、降血壓、修復(fù)潰瘍、改善免疫功能等作用，其抗菌有效成分是小檗堿［7-8］。地榆炭味苦，性涼，具有涼血止血之功效［9-10］。大黃味苦，性寒，具有瀉下攻積、瀉火解毒、活血祛瘀及清泄?jié)駸岬裙π?，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大黃不僅具有瀉下、利膽、保肝的作用，還有止血、抗感染的作用［11］。大黃抗菌有效成分是大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素，其抗菌作用機(jī)制是影響葉酸的酶系統(tǒng)，抑制細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)菌生物氧化酶系統(tǒng)，誘生干擾素［12-13］。因此，無(wú)論從中醫(yī)理論，還是現(xiàn)代藥理學(xué)角度來(lái)看，復(fù)方芙蓉花葉均能有效抗菌和促進(jìn)傷口愈合。此外，復(fù)方芙蓉花葉膏在肛周疾病及肛周術(shù)后的臨床應(yīng)用中，也證實(shí)了其具有較強(qiáng)的抗菌和促進(jìn)傷口愈合的作用。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)水提取的提取率最高，其抑菌作用較乙醇提取強(qiáng)；經(jīng)乙酸乙酯萃取盡管提取率最低，但其抑菌作用最強(qiáng)。應(yīng)用揮發(fā)性有機(jī)溶劑提取中藥，能有效、快速地提取有效成分。應(yīng)用乙醇有機(jī)溶劑提取，不僅能快速去除水溶性雜質(zhì)，還能保證有效成分的完整性［14-15］。乙酸乙酯萃取是在乙醇提取基礎(chǔ)上進(jìn)一步萃取，進(jìn)一步濃縮有效成分。3種提取方案均是為了濃縮有效成分，去除雜質(zhì)。

復(fù)方芙蓉花葉提取物對(duì)大腸桿菌及表皮葡萄球菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，3種提取方案對(duì)大腸埃希菌和表皮葡萄球菌均有明顯的抑菌效果，但對(duì)表皮葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于大腸埃希菌，這可能是復(fù)方芙蓉花葉中某一種物質(zhì)對(duì)表皮葡萄球菌有特異性抑菌活性。3種提取物的MIC表明，乙酸乙酯萃取物對(duì)大腸埃希菌及表皮葡萄球菌的MIC最小，盡管乙酸乙酯萃取過(guò)程較其他2種方法復(fù)雜，提取率也最低，但抑菌效果最佳。

表2 3種提取方法的復(fù)方芙蓉花葉提取物體外抑菌效果比較

表3 3種提取方法的復(fù)方芙蓉花葉提取物對(duì)試驗(yàn)菌的 MIC（g／L）

綜上所述，乙醇提取、乙酸乙酯萃取及水提取復(fù)方芙蓉花葉的提取物均能對(duì)大腸埃希菌和表皮葡萄球菌產(chǎn)生抑菌作用，其中抑菌效果最佳的提取方法是乙酸乙酯萃取。