石春林 ，沙前坤 ，陳 瑾 ，劉 俊

（1.重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院，重慶 402100； 2.重慶央都生物研究院藥學(xué)部，重慶 408000； 3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，重慶 400016； 4.重慶市沙坪壩陳家橋醫(yī)院，重慶 401331）

在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成過程中，其誘發(fā)因素較多，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的炎性損傷是其中最重要的因素，其作用機(jī)制表現(xiàn)為：ox-LDL作用→巨噬細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)皮→形成泡沫細(xì)胞→粥樣硬化斑塊形成［1］。ox-LDL與血管炎性反應(yīng)密切相關(guān)，單核細(xì)胞趨化因子 1（MCP-1）、白細(xì)胞介素 6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等均為常見炎性因子，其表達(dá)會(huì)直接影響細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化而損傷血管內(nèi)膜，進(jìn)而參與到動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成中［2-3］?；ⅫS燒傷搽劑為中醫(yī)常見制劑，具有瀉火解毒、涼血活血、消腫止痛、燥濕斂瘡等功效，含有多酚類植物抗毒素白藜蘆醇苷。白藜蘆醇苷是組蛋白去乙?；赋聊畔⒄{(diào)控因子（SIRT1）家族的主要激動(dòng)劑，有保護(hù)心肌、延緩衰老及抗炎抗氧化作用［4-5］。劉雅倩等［6］的研究指出，白藜蘆醇苷能增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞的增殖能力，抑制炎性因子的表達(dá)，但其作用機(jī)制尚不明確。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，白藜蘆醇苷能通過調(diào)控SIRT1蛋白對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞的增殖能力起到有效作用［7］，也能抑制炎性因子的產(chǎn)生，但由于國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不多見，具可靠性和真實(shí)性有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究中探討了白藜蘆醇苷對(duì)巨噬細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞因子的干預(yù)作用及作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：TP-1200C型電子天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司，精度為 0.01 g）；1658001 型電泳儀（美國Bio-Rad有限公司）；PY-16型恒溫培養(yǎng)箱（南京暢翔儀器設(shè)備有限公司）；WD-9405F型脫色搖床（北京六一生物科技有限公司）；1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；SAT-680T型酶標(biāo)儀（上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司）。

試藥：THP-1人單核細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞中心）；虎黃燒傷搽劑（重慶喜旋生物科技有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20010151，規(guī)格為每瓶50 mL）；白藜蘆醇苷（中國藥品生物制品檢定所，純度大于98%，規(guī)格為每瓶 20 mg）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國 Gibco公司）；TNF-α及IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（深圳晶美生物有限公司）；CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗或生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，HRP標(biāo)記的鏈霉親和素（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 THP 巨噬細(xì)胞制備

細(xì)胞復(fù)蘇后均勻平鋪于培養(yǎng)基中，加入含100 mL／L胎牛血清的培養(yǎng)液，置含50 mL／L CO2的37℃電熱恒溫箱孵育，細(xì)胞匯合至0左右，以2×104個(gè)／mL細(xì)胞數(shù)接種于 96 孔板，每孔 100 μL，包含 160 nmol／L PMA 培養(yǎng)液，置含50 mL／L CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)貼壁36 h，棄培養(yǎng)液，每孔再加入培養(yǎng)液100 μL。在白藜蘆醇苷處理前添加 0，30，90 μmol／L ox-LDL 對(duì)巨噬細(xì)胞預(yù)處理 4 h，用 5，25，50 μmol／L 白藜蘆醇苷分別處理巨噬細(xì)胞 4，8，16 h。將所有THP-1巨噬細(xì)胞分為3組。對(duì)照組僅加入普通培養(yǎng)基，ox-LDL組加入ox-LDL，白藜蘆醇苷組加入白藜蘆醇苷。以白藜蘆醇苷作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)虎黃燒傷搽劑中的白藜蘆醇苷進(jìn)行含量測(cè)定［8-9］。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

將各處理組終點(diǎn)細(xì)胞，在 96孔板加入100 μL CCK-8工作液，置37℃恒溫箱孵育過夜。次日，避光采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各細(xì)胞標(biāo)本的吸光度（A）值。

1.2.3 炎性因子水平測(cè)定

收集處理后的細(xì)胞，用蛋白提取試劑盒分別提取細(xì)胞總蛋白及核蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取蛋白質(zhì)40 μg，10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉 2 h，加入一抗，分別加入小鼠抗MCP-1抗體（1∶500）、小鼠抗IL-6抗體（1∶1 000）、小鼠抗 TNF-α 抗體（1 ∶800），室溫孵育12 h，TBST緩沖液洗膜30 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；TBST洗膜30 min，采用蛋白質(zhì)印跡（WB）熒光檢測(cè)試劑激發(fā)熒光，顯示于X光片，顯影，定影，進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以X±s表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，多組間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較行SNK法。相關(guān)性分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在ox-LDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞增殖能力中的作用

采用 0，30，90 μmol／L ox-LDL 對(duì) THP-1 巨噬細(xì)胞預(yù)處理 4 h 后，采用 5，25，50 μmol／L 白藜蘆醇苷分別處理巨噬細(xì)胞，于4，8，16 h時(shí)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，THP-1巨噬細(xì)胞增殖活性與ox-LDL處理濃度和時(shí)間有一定相關(guān)性，除去90 μmol／L ox-LDL處理16 h THP-1巨噬細(xì)胞的增殖活性低于8 h外，其余均表現(xiàn)為濃度越高，時(shí)間越長(zhǎng)，增殖活性越強(qiáng)。詳見表1。

表1 ox-LDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞增殖活性的時(shí)間和濃度依賴性（X±s）

選擇 90 μmol／L ox-LDL，進(jìn)一步分析白藜蘆醇苷在增強(qiáng)ox-LDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞增殖能力中的作用。在 ox-LDL 處理后，添加 5，25，50 μmol／L 3 種濃度的白藜蘆醇苷處理4 h后，THP-1巨噬細(xì)胞增殖活性分別為 （1.25±0.34）A，（1.36±0.41）A，（1.49±0.51）A。結(jié)果顯示，與ox-LDL處理組相比，白藜蘆醇苷的濃度達(dá)到50 μmol／L時(shí)，其對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞增殖活性的影響最顯著。

2.2 白藜蘆醇苷在增強(qiáng)ox-LDL抑制炎性因子表達(dá)中的作用

ox-LDL組的MCP-1，IL-6，TNF-α炎性因子水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇苷組MCP-1，IL-6，TNF-α炎性因子水平高于對(duì)照組，但低于 ox-LDL 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示白藜蘆醇苷能抑制炎性因子的表達(dá)，其中可能與增強(qiáng)ox-LDL誘導(dǎo)有關(guān)。詳見表2和圖1。

表2 3組相關(guān)炎性因子水平比較（±s，ng ／L）

表2 3組相關(guān)炎性因子水平比較（±s，ng ／L）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與 ox-LDL 組，△P ＜0.05。

組別對(duì)照組ox-LDL組白藜蘆醇苷組MCP-1 12.54 ± 3.67 27.41 ± 8.12*16.58 ± 4.91△IL-6 65.45 ± 13.47 102.62 ± 23.08*84.15 ± 20.64△TNF-α 1.65 ± 0.54 2.89 ± 0.76*2.03 ± 0.61△

圖1 巨噬細(xì)胞MCP-1，IL-6，TNF-α蛋白水平

3 討論

巨噬細(xì)胞介導(dǎo)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê?jiǎn)稱冠心病）的主要病理機(jī)制。脂質(zhì)蛋白被氧化修飾作用后，會(huì)入侵受損的內(nèi)皮細(xì)胞，在趨化因子的作用下導(dǎo)致單核細(xì)胞發(fā)生遷移至內(nèi)膜下，單核細(xì)胞膜體與ox-LDL相結(jié)合，分化成巨噬細(xì)胞，并分泌多種促炎因子，較常見的有 IL-6，IL-8，TNF-α等，使平滑肌層細(xì)胞遷移、內(nèi)皮細(xì)胞增生，增加粥樣斑塊的不穩(wěn)定性［10-11］。可見，單核巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)直接影響斑塊的穩(wěn)定性。因此，干預(yù)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化必須對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，以此提升治療效果，達(dá)到治療目的。

在巨噬細(xì)胞的分化過程中，ox-LDL具有至關(guān)重要的作用［12］。借助巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮整合素家族受體結(jié)合，ox-LDL能誘導(dǎo)局部促進(jìn)炎性反應(yīng)損傷血管內(nèi)膜，產(chǎn)生一系列細(xì)胞分化增殖異常反應(yīng)［13］。MA 等［14］研究認(rèn)為，ox-LDL是促使巨噬細(xì)胞參與形成不穩(wěn)定斑塊的重要因素，誘導(dǎo)斑塊周邊細(xì)胞增殖與過度凋亡，增加了脂質(zhì)池內(nèi)部的容積，減少了纖維帽鈣化的硬度。本研究結(jié)果顯示，THP-1巨噬細(xì)胞增殖效應(yīng)與ox-LDL呈一定的時(shí)間和濃度依賴性。其中，30 μmol／L干預(yù)16 h時(shí)增殖效果最顯著。進(jìn)一步分析炎性因子水平的變化情況發(fā)現(xiàn)，IL-6，TNF-α等水平在ox-LDL作用后均有不同程度的升高，證實(shí)了ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖與炎性因子的介導(dǎo)有關(guān)。MCP-1是核因子 κB（NF-κB）的調(diào)控關(guān)鍵糖蛋白，是炎癥介導(dǎo)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，能直接誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞趨化遷移，對(duì)IL-6，TNF-α炎性細(xì)胞因子的表達(dá)具有激活作用［15］。SHAYGANNI等［16］研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成過程中，會(huì)被過度修飾的脂質(zhì)蛋白直接激活炎癥通路，使MCP-1的表達(dá)得到增加，發(fā)生平滑細(xì)胞的過度增殖。本研究結(jié)果顯示，在ox-LDL作用下，除IL-6和TNF-α上升外，MCP-1也明顯增加，表明ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的增殖，與MCP-1的表達(dá)密切相關(guān)。白藜蘆醇苷是一種多酚類中藥提取物，是SIRT1的有效激活劑，可改善細(xì)胞代謝，對(duì)自噬水平的調(diào)控也有一定作用。研究表明，白藜蘆醇苷能有效抑制NF-κB的活性水平，促進(jìn)谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)［17］。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇苷作用后，巨噬細(xì)胞明顯增殖，同時(shí)MCP-1，IL-6，TNF-α炎性細(xì)胞因子水平明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)了白藜蘆醇苷在ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖中的作用，抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)的效應(yīng)被抑制。

綜上所述，虎黃燒傷搽劑中白藜蘆醇苷能增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞的增殖能力，抑制炎性因子的表達(dá)，可能與減少ox-LDL誘導(dǎo)有關(guān)。