崔天琦 呂欣然 孫夢(mèng)桐 馬國(guó)涵 白鳳翎 杜 宏 勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 遼寧錦州121013）

細(xì)菌性疾病是阻礙水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵性問(wèn)題之一，應(yīng)用抗生素控制細(xì)菌性感染是許多國(guó)家防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的主要方法[1]，然而大量使用抗生素導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，與抗生素使用劑量和頻率之間形成惡性循環(huán)[2]。引起水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類細(xì)菌性感染的病原體多為水體生態(tài)環(huán)境中的革蘭氏陰性菌，通常通過(guò)群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）現(xiàn)象如形成生物膜、毒力因子和遷移能力發(fā)揮致病作用[3]。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種導(dǎo)致人-獸-水生動(dòng)物共患病的革蘭氏陰性條件致病菌，可引起鯉魚(yú)、金錢(qián)魚(yú)、黃鱔和大菱鲆等多種水生動(dòng)物出現(xiàn)敗血癥[4-5]。應(yīng)用群體感應(yīng)抑制劑（Quorum sensing inhibitor，QSIs）和群體感應(yīng)淬滅作用控制細(xì)菌性疾病是目前一種生態(tài)友好型策略[6]。

大多革蘭氏陰性菌QS是由AHLs 信號(hào)分子介導(dǎo)的。阻斷、干擾和破壞QS 的機(jī)制主要由2種[7]：一是利用干擾AHLs 信號(hào)分子的化合物，即QSIs阻斷細(xì)胞間分子信息傳遞，例如紅海藻（Delisea pulchra）合成的鹵代呋喃酮[8]；二是利用群體感應(yīng)淬滅酶降解或轉(zhuǎn)化AHLs 信號(hào)分子，使其失去信息傳遞功能，稱為群體感應(yīng)淬滅作用（Quorum quenching，QQ）[9]。群體感應(yīng)淬滅酶主要包括AHLs-內(nèi)酯酶、AHLs-?；D(zhuǎn)移酶和氧化還原酶3種類型[10-11]。研究表明海洋生態(tài)環(huán)境中放線菌（Actino bacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）的微生物類群可以產(chǎn)生對(duì)AHLs 具有淬滅作用的酶[12]。Romero等[13]證明海洋細(xì)菌 黃桿菌屬（Tenacibaculum sp.）20J 的粗提物對(duì)魚(yú)類病原性弧菌遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）AHLs 信號(hào)分子具有淬滅活性；Kiymaci等[14]從新生兒糞便中分離出潛在的益生菌菌株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）M7 中的乳酸，檢測(cè)其對(duì) 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）QS 信號(hào)分子和某些毒力因子的抑制作用，結(jié)果顯示乳酸對(duì)短鏈HSL的產(chǎn)生、群集泳動(dòng)、蛋白酶、綠膿菌素和生物膜形成具有一定的抑制作用；Pattnaik等[15]利用真菌大豆莖潰瘍病菌（Diaporthe phaseolorum）SSP12 抑制了銅綠假單胞菌PAO1 群體感應(yīng)調(diào)控的毒力因子及生物膜的形成。Torres等[16]從雙殼貝類孵化場(chǎng)分離的450種菌株中篩選出具有QQ 活性的菌株——極地寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌（Alteromonas stellipolaris）PQQ-42，其能降解多種AHLs，在體外共培養(yǎng)試驗(yàn)中抑制了4種病原性弧菌AHLs 的積累，并抑制弧菌種類中蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生以及群集泳動(dòng)性。

乳酸菌是一類具有拮抗作用和益生功能的生態(tài)友好型細(xì)菌，主要存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道及土壤淤泥等自然環(huán)境中[17]。以乳酸鏈球菌素為代表的乳酸菌生物制劑具有安全高效、綠色無(wú)殘留等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品和水產(chǎn)品等的防腐保鮮[18]。乳酸菌是否具有淬滅革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)的作用，以及其能否作為微生物源性QSIs 應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌的防控，在國(guó)內(nèi)外研究中鮮見(jiàn)報(bào)道。

本文從傳統(tǒng)發(fā)酵食品以及海水魚(yú)腸道中分離的乳酸菌中篩選對(duì)嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)AHLs信號(hào)分子具有降解作用的菌株，探究乳酸菌對(duì)革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)的淬滅作用機(jī)制，對(duì)利用活性乳酸菌制劑防控水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的感染具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及培養(yǎng)條件 乳酸菌菌株：傳統(tǒng)發(fā)酵食品和海水魚(yú)腸道中篩選得到156 株乳酸菌菌株，其中，來(lái)源于遼寧錦州酵頭、遼寧朝陽(yáng)咸菜等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的乳酸菌菌株有124 株，來(lái)源于牙鲆、帶魚(yú)等魚(yú)類腸道的乳酸菌32 株。

指示菌株：紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026 為紫色桿菌ATCC 31532 的mini-Tn5 突變體，自身不產(chǎn)生N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子（AHLs），僅當(dāng)外源 AHLs 存在時(shí)，菌株可產(chǎn)生紫色菌素，可檢測(cè)到C4-HSL，C8-HSL的信號(hào)分子。

目標(biāo)菌株：嗜水氣單胞菌LY-2，分離自腐敗大菱鲆體表。

以上菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 MRS 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、DNA 酶培養(yǎng)基、酪蛋白培養(yǎng)基、血瓊脂基本培養(yǎng)基、無(wú)菌脫纖維羊血，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乳酸菌生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司；卡那霉素、細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、DNA marker-D、Taq PCR Master mix，上海生工生物工程有限公司；C4-HSL、C6-HSL 信號(hào)分子標(biāo)品，美國(guó)Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-2N 超級(jí)潔凈工作臺(tái)，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-250 生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；IKA Vortex GENIUS 3 振蕩器，德國(guó)IKA 公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)、ABI stepone plus PCR 儀，德國(guó)Eppendorf 公司；DYY-8C 電泳儀，北京市六一儀器廠；Quantity One 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；MS105UD電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；Imark 酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD；GI54DS 立式高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門(mén)）儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Labconco Free Zone 2.5 臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀7890A-5975C，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化及嗜水氣單胞菌AHLs 粗提物的制備 乳酸菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，以2.0%的接種量傳代培養(yǎng)2 次后于37 ℃培養(yǎng)12 h。嗜水氣單胞菌和紫色桿菌分別接種于LB 液體培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)2 次后于30 ℃培養(yǎng)12 h；取4 mL 2 代紫色桿菌以及200 μL 卡那霉素于200 mL LB培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)24 h，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將活化后的嗜水氣單胞菌于4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min 得上清液，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾獲得嗜水氣單胞菌無(wú)細(xì)胞上清液（Cell free supernatants，CFS），4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ∈人畾鈫伟鶦FS 100 mL 置于250 mL 分液漏斗中，將含有0.01%冰醋酸的等量乙酸乙酯分5 次加入萃取，加入溶劑后沿同一方向緩慢震蕩后靜置，待分層明顯時(shí)收集乳化層置于三角瓶中。將5 次萃取液合并，在45 ℃，120 r/min 條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機(jī)溶劑氣味消失，將殘留液轉(zhuǎn)存至無(wú)菌1.5 mL 離心管中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇懸浮，置于-18 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌的初篩采用96 孔微量板法測(cè)定乳酸菌菌株對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs 的降解活性。取10.0 μL 嗜水氣單胞菌AHLs 粗提物加入到乳酸菌2 代培養(yǎng)物中（調(diào)節(jié)pH 7.0），30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。取24 h 培養(yǎng)物調(diào)節(jié)pH 至7.0，于4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min 后取培養(yǎng)物上清液，備用。

將LB 瓊脂加到96 微孔板的孔中并使其干燥，將培養(yǎng)物上清液在軟瓊脂表面上點(diǎn)樣，頂層用100 μL 含有紫色桿菌（體積比5∶1）的LB 軟瓊脂覆蓋，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。將相同量的嗜水氣單胞菌AHLs 加入到無(wú)細(xì)胞MRS 液體培養(yǎng)基中，并按相同條件培養(yǎng)并點(diǎn)樣在微孔板上，作為陰性對(duì)照。

1.3.3 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌的復(fù)篩采用瓊脂平板擴(kuò)散法對(duì)具有降解活性的初篩菌株復(fù)篩。取10.0 μL 嗜水氣單胞菌AHLs 粗提物添加到2 代乳酸菌培養(yǎng)物中（調(diào)節(jié)pH 7.0），30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)物于4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min，獲得培養(yǎng)物上清液，備用。

取2.0 mL 紫色桿菌與25.0 mL LB 瓊脂混勻，倒入底層鋪有素瓊脂的平板中，用牛津杯打孔，在孔內(nèi)加入180 μL 培養(yǎng)物上清液，于30 ℃條件下旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)量孔周圍出現(xiàn)的紫色暈圈直徑。將相同量嗜水氣單胞菌AHLs 加入到1.0 mL 無(wú)細(xì)胞MRS 液體培養(yǎng)基中，與按相同條件培養(yǎng)并加入到牛津杯孔內(nèi)，作為陰性對(duì)照。乳酸菌對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs 降解率按式（1）計(jì)算：

式中，D（對(duì)照）——對(duì)照組紫色圈直徑，mm；D（QSI）——乳酸菌處理組紫色圈直徑，mm。

1.3.4 乳酸菌粗提物的制備 取乳酸菌CFS 100 mL 于250 mL 分液漏斗中，將等量乙酸乙酯分5次加入萃取，加入溶劑后沿同一方向緩慢振蕩后靜置，待分層明顯時(shí)收集乳化層置于三角瓶中。將5 次萃取液合并，于45 ℃，120 r/min 條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機(jī)溶劑氣味消失，殘留液轉(zhuǎn)存至無(wú)菌錐形瓶中，真空冷凍干燥制成粉末，置于-18 ℃冰箱備用。

1.3.5 AHLs 降解活性的測(cè)定

1.3.5.1 樣品制備 采用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇將C4-HSL 和C6-HSL 信號(hào)分子標(biāo)品配制成200 μg/L 的溶液，備用。

乳酸菌粗提物和嗜水氣單胞菌上清液的共培養(yǎng)物按1.3.1 節(jié)步驟萃取AHLs 信號(hào)分子，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的殘留液轉(zhuǎn)存至無(wú)菌1.5 mL 離心管中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇懸浮，置于-18 ℃冰箱保存。樣品及溶劑均經(jīng)0.45 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾處理。

1.3.5.2 乳酸菌降解AHLs 活性的分析 采用安捷倫Agilent 7890A/5975C 進(jìn)行GC-MS 分析，氣相色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 μm×250 μm×0.25μm）；載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為200 ℃；傳輸線溫度為280 ℃。升溫程序采用3 階段升溫，第1階段：初溫150 ℃，溶劑保留時(shí)間為3 min，以10℃/min 的升溫速率升到220 ℃，運(yùn)行時(shí)間7 min；第2 階段：以5 ℃/min 的升溫速率升到250 ℃，運(yùn)行時(shí)間6 min；第3 階段：以0.5 ℃/min 的升溫速率升到252.5 ℃，運(yùn)行時(shí)間5 min。進(jìn)樣量為1.0 μL，分流進(jìn)樣，分流比50：1，運(yùn)行總時(shí)間18 min。質(zhì)譜條件：電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃。掃描方式為全掃描模式m/z 15～800 和選擇離子檢測(cè)（SIM）模式m/z 143。

1.3.6 乳酸菌QQ 酶的鑒定 參照Romero等[13]的方法稍作修改。將嗜水氣單胞菌AHLs 和乳酸菌培養(yǎng)物在4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min，將上清液用1.0 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至2.0，于30 ℃條件下孵育24 h，采用瓊脂平板擴(kuò)散法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7 QQ 活性位置的確定 為確定乳酸菌菌株的QS AHLs 降解活性位置，參照Torres等[16]的方法稍作修改。采用具有AHLs 降解活性菌株24 h培養(yǎng)物的CFS 和粗細(xì)胞提取物（Crude cell extract，CCE）分析降解活性位置。將15.0 mL 乳酸菌的過(guò)夜培養(yǎng)物于4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min，獲得培養(yǎng)物上清液，經(jīng)0.45 μm 過(guò)濾器過(guò)濾獲得CES，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將乳酸菌沉淀物用15.0 mL pH 6.5 的PBS洗滌，加5.0 mL 相同緩沖液重懸，在冷水浴中間歇超聲（35 kHz）處理5 min，于4 ℃，10 000 r/min條件下離心30 min，獲得的CCE 經(jīng)0.45 μm 過(guò)濾器過(guò)濾后，于4 ℃冰箱貯存。

在1.0 mL CFS 和1.0 mL CCE 中分別添加10.0 μL 嗜水氣單胞菌AHLs 粗提物，測(cè)定乳酸菌CFS 和CCE 對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs 的降解活性。在25 ℃，150 r/min 條件下旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)24 h，采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定嗜水氣單胞菌粗提物中AHLs剩余量。

1.3.8 乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌和紫色桿菌的MIC 測(cè)定 采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將乙酸乙酯萃取后的乳酸菌粗提物蒸發(fā)至無(wú)乙酸乙酯氣味，真空冷凍干燥制成粉末，于-18 ℃冰箱備用。用LB 液體培養(yǎng)基將嗜水氣單胞菌3 代培養(yǎng)物稀釋至106 CFU/mL 后，分別加入乳酸菌粗提物粉末至終質(zhì)量濃度分別為16.0，12.0，8.0，6.0，4.0，2.0，0 mg/mL。以添加5.0 mL 不同質(zhì)量濃度乳酸菌粗提物的處理組為試驗(yàn)組，以不加粗提物的LB 培養(yǎng)基為對(duì)照組，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。通過(guò)肉眼觀察無(wú)渾濁現(xiàn)象的試管確定MIC，每組重復(fù)3 次。

1.3.9 亞MIC 水平乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)的影響 將嗜水氣單胞菌用LB 肉湯稀釋成106CFU/mL 菌懸液。將190 μL 菌懸液加入96孔板中，再分別加入10.0 μL 的0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物，以LB 培養(yǎng)基作陰性對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h 在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定OD 值。

1.3.10 亞MIC 水平乳酸菌粗提物對(duì)紫色桿菌紫色桿菌素的降解 取0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物和嗜水氣單胞菌共培養(yǎng)物的上清液，采用瓊脂擴(kuò)散法初步檢測(cè)其降解活性。

參照Rahman等[20]的方法稍作修改。將紫色桿菌培養(yǎng)物分別接種到0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物和嗜水氣單胞菌共培養(yǎng)物中，孵育24 h。將培養(yǎng)物在13 000 r/min 下離心10 min 沉淀不溶性紫色桿菌素。取沉淀物重懸于二甲基亞砜中，震蕩30 s 使紫色桿菌素完全溶解，13 000 r/min 離心10 min 除去細(xì)菌細(xì)胞。利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)585 nm 處測(cè)量上清液吸光度。以紫色桿菌和嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照。按式（2）計(jì)算降解率：

式 中，ODcontrol——對(duì)照組在OD585nm值；ODQSI——乳酸菌處理組OD585nm值。

1.3.11 乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)表型的影響 將0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物和嗜水氣單胞菌的共培養(yǎng)物上清液分別點(diǎn)樣到酪蛋白培養(yǎng)基、DNA 酶瓊脂培養(yǎng)基、含體積分?jǐn)?shù)1.0%吐溫80 的LB 瓊脂、含質(zhì)量比1.0%淀粉的LB 瓊脂、血液瓊脂培養(yǎng)基、群集和泳動(dòng)培養(yǎng)基表面的濾紙片上，30 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌中蛋白酶、DNA 酶、脂肪酶、淀粉酶、溶血性、群集和泳動(dòng)現(xiàn)象的作用結(jié)果。同時(shí)MRS 液體培養(yǎng)基加入相同量的嗜水氣單胞菌上清液作陰性對(duì)照。

1.3.12 乳酸菌菌株鑒定

1.3.12.1 生理生化反應(yīng) 挑選對(duì)嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)AHLs 信號(hào)分子具有降解作用的乳酸菌菌株，參照文獻(xiàn)[21-23]進(jìn)行菌株生理生化反應(yīng)。

1.3.12.2 16S rRNA 序列分析 吸取1.0 mL 乳酸菌菌株12 h 培養(yǎng)物上清液加到1.5 mL EP 管中，12 000 r/min 離心5 min，采用DNA 快速抽提試劑盒提取菌株DNA，以16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。正向引物為27F（5’-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3’），反向引物為1492R（5’-TACG GYTACCTTTGTTACGACTT-3’），引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為DNA 模板1.0 μL，Taq PCR Master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，總體積25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃，預(yù)變性2 min；94 ℃，變性1 min；60 ℃，退火1 min；72 ℃，延伸90 s；72 ℃，保持10 min；循環(huán)30 次，4 ℃保溫。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察凝膠成像系統(tǒng)的擴(kuò)增效果并照相。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)校對(duì)后與NCBI 上Genebank 數(shù)據(jù)庫(kù)中己有序列進(jìn)行 BLAST 比對(duì)分析，運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建乳酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3.13 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 22.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)平行3 次，采用Origin 7.5制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌的初篩

以紫色桿菌為生物傳感器，采用96 孔微量板法篩選降解嗜水氣單胞菌AHLs 的結(jié)果如圖1所示，156 株乳酸菌中有56 株不產(chǎn)生紫色或產(chǎn)生量遠(yuǎn)小于對(duì)照組，表明這些菌株具有降解AHLs 活性，初篩率為35.90%。

圖1 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌菌株的初篩結(jié)果Fig.1 Primary screening of lactic acid bacteria strains degrading A.hydrophila AHLs

2.2 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌的復(fù)篩

采用瓊脂擴(kuò)散法從初篩菌株中復(fù)篩降解活性較強(qiáng)的乳酸菌。由表1可知，來(lái)源于內(nèi)蒙古寧城酸辣椒和安徽績(jī)溪酸菜的菌株NNL 2-5 和AJS 3-4 的降解率分別為43.71%和46.19%；來(lái)源于遼寧大連腌黃瓜的菌株DLH 513 和遼寧沈陽(yáng)酸湯面的菌株STM 1-5-4 的降解率分別為 53.12%和71.11%；來(lái)源于遼寧錦州渤海牙鲆腸道的菌株YP 4-1-1 幾乎無(wú)紫色暈圈產(chǎn)生，表明其降解活性最強(qiáng)，接近100%。從結(jié)果可以看出不同來(lái)源的乳酸菌降解AHLs 活性差異性很大，選擇菌株YP 4-1-1 進(jìn)行后續(xù)的淬滅作用研究。

表1 降解嗜水氣單胞菌AHLs 乳酸菌菌株的復(fù)篩結(jié)果Table 1 Re-screening of lactic acid bacteria strains degrading A.hydrophila AHLs

2.3 YP 4-1-1 降解嗜水氣單胞菌AHLs 活性

采用GC-MS 測(cè)定菌株YP 4-1-1 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs 信號(hào)分子降解活性。由表2可知，YP 4-1-1 粗提物對(duì)C4-HSL 和C6-HSL2類分子的降解率分別為98.31%和81.81%，說(shuō)明其對(duì)C4-HSL 的降解活性顯著高C6-HSL。介導(dǎo)嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)的AHLs 信號(hào)分子由多種成分構(gòu)成，而對(duì)C4-HSL 和C6-HSL2類主要分子的降解作用基本可反映菌株YP 4-1-1 的降解作用，該結(jié)果與瓊脂擴(kuò)散法基本一致，后續(xù)試驗(yàn)均選擇YP 4-1-1 進(jìn)行。

表2 YP 4-1-1 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs 信號(hào)分子的降解作用Table 2 Degradation of A.hydrophila AHLs signaling molecules by YP 4-1-1 crude extracts

2.4 YP 4-1-1 群體感應(yīng)淬滅酶及其活性位置分析

YP 4-1-1 群體感應(yīng)淬滅酶及其活性位置分析結(jié)果見(jiàn)圖2。酸性條件將會(huì)導(dǎo)致AHLs 內(nèi)酯環(huán)在其先前被內(nèi)酯酶打開(kāi)的情況下發(fā)生自身重組，其中由圖2a可知，在pH 7.0 和pH 2.0 下，與對(duì)照組相比，YP 4-1-1 處理組皆無(wú)紫色暈圈產(chǎn)生，并且培養(yǎng)物酸化后AHLs 濃度沒(méi)有恢復(fù)即無(wú)紫色圈產(chǎn)生，說(shuō)明pH 2.0 時(shí)酶的活性沒(méi)有恢復(fù)，表明具有降解作用的不是AHLs-內(nèi)酯酶，可能是AHLs-?；D(zhuǎn)移酶或氧化還原酶。由圖2b可知，菌株YP 4-1-1 的CCE 對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs 具有降解活性，而菌株YP 4-1-1 的CFS 和陰性對(duì)照MRS 培養(yǎng)基相比，具有一定降解活性，但不顯著，表明在CCE可溶性部分中存在具有QQ 活性的酶。

圖2 YP 4-1-1 的群體感應(yīng)淬滅酶及其活性位置分析Fig.2 Quorum quenching enzyme and its active position of YP 4-1-1 analysis

2.5 YP 4-1-1 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌和紫色桿菌的MIC

菌株YP 4-1-1 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌和紫色桿菌的MIC 分別為2.0 mg/mL 和4.0 mg/mL。為了不影響菌株生長(zhǎng)，菌株YP 4-1-1 粗提物選擇3個(gè)亞MIC 即0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 進(jìn)行后續(xù)研究。

2.6 嗜水氣單胞菌和紫色桿菌的生長(zhǎng)曲線分析

由圖3可知，與MRS 培養(yǎng)基相比，經(jīng)0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC3 個(gè)亞MIC 的YP 4-1-1粗提物處理后的嗜水氣單胞菌和紫色桿菌的生長(zhǎng)曲線處于同一生長(zhǎng)水平，表明亞MIC 的YP 4-1-1 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌和紫色桿菌生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用。

圖3 YP 4-1-1 粗提物對(duì)紫色桿菌CV026（a）和嗜水氣單胞菌LY-2（b）生長(zhǎng)曲線的影響Fig.3 Effects of YP 4-1-1 crude extraction on growth curves of C.violaceum CV026（a）and A.hydrophila LY-2（b）

2.7 YP 4-1-1 粗提物對(duì)紫色桿菌素的降解作用

YP 4-1-1 粗提物對(duì)紫色桿菌素降解作用的瓊脂擴(kuò)散結(jié)果如圖4a所示。由圖4a可知，隨著YP 4-1-1 粗提物質(zhì)量濃度升高，紫色暈圈的直徑逐漸減小，說(shuō)明其對(duì)紫色桿菌素的降解作用越強(qiáng)。YP 4-1-1 粗提物對(duì)液體培養(yǎng)基中紫色桿菌素降解結(jié)果如圖4b所示。由圖4b可知，YP 4-1-1 粗提物的質(zhì)量濃度越高對(duì)紫色桿菌素的降解作用越強(qiáng)，并且具有質(zhì)量濃度依賴性。說(shuō)明YP 4-1-1 粗提物在亞MIC 條件下對(duì)紫色桿菌QS 介導(dǎo)的紫色桿菌素有較好的降解作用。

圖4 YP 4-1-1 對(duì)紫色桿菌素的降解作用Fig.4 Degradation of purple bacillus by YP 4-1-1

2.8 YP 4-1-1 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)表型的影響

采用0.0，1.0，2.0，3.0 mg/mL 的菌株YP 4-1-1 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌部分生物表型的作用結(jié)果如圖5所示。圖5a～d是YP 4-1-1 粗提物對(duì)淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和DNA 酶水解活性影響，當(dāng)質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL 時(shí)，幾乎均不產(chǎn)生水解圈，其余2 個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)其活性影響不顯著，由此看出，乳酸菌粗提物可抑制嗜水氣單胞菌4種酶的產(chǎn)生。

YP 4-1-1 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌溶血性的影響如圖5e所示，溶血圈的大小隨著YP 4-1-1粗提物質(zhì)量濃度的增大而減小，由此看出，乳酸菌粗提物可顯著抑制嗜水氣單胞菌溶血性的產(chǎn)生，降低其致病性。

由圖5f可知，與對(duì)照組相比乳酸菌粗提物處理組嗜鐵素的生成量顯著降低。乳酸菌粗提物處理組的黃色圈明顯小于空白組，隨著乳酸菌粗提質(zhì)量物濃度的增大，黃色圈的直徑逐漸減小，說(shuō)明乳酸菌粗提物能夠有效抑制嗜水氣單胞菌嗜鐵素的產(chǎn)生進(jìn)而使其致病能力減弱。

乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌泳動(dòng)和群集的影響如圖5g～h所示。隨著乳酸菌粗提物質(zhì)量濃度的增加，嗜水氣單胞菌遷移直徑均呈逐漸下降的趨勢(shì)。

圖5 YP 4-1-1 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌部分表型的影響Fig.5 Effects of YP 4-1-1 crude extraction on virulent factor of A.hydrophila LY-2

2.9 乳酸菌菌株鑒定

菌株YP 4-1-1 的生理生化反應(yīng)結(jié)果如表3所示，依照文獻(xiàn)[22-23]可初步斷定菌株YP 4-1-1為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）。

表3 菌株YP 4-1-1 的生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical test results of strain YP 4-1-1

圖6 菌株YP 4-1-1 的16S rRNA 基因擴(kuò)增電泳圖Fig.6 PCR amplification of 16S rRNA gene of strain YP 4-1-1

圖6是菌株YP 4-1-1 的16S rRNA 基因擴(kuò)增電泳圖。由圖6可知可以看出菌株YP 4-1-1核酸序列在1 400 bp 左右出現(xiàn)特異性亮帶，表明目標(biāo)片段被成功擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將菌株測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，菌株YP 4-1-1與清酒乳桿菌MG669329.1 在同一個(gè)分支上，置信度為99%，因此菌株YP 4-1-1 被鑒定為清酒乳桿菌，該結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果相同。

3 結(jié)論

本文從傳統(tǒng)發(fā)酵食品以及海水魚(yú)腸道中篩選出一株對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs 信號(hào)分子具有降解作用的菌株YP 4-1-1，對(duì)嗜水氣單胞菌C4-HSL，C6-HSL 信號(hào)分子的降解活性接近100%，YP 4-1-1 酶解AHLs 活性初步鑒定不是AHLs-內(nèi)酯酶的作用，可能是AHLs-?；D(zhuǎn)移酶或氧化還原酶的作用。經(jīng)生理生化反應(yīng)和16S rRNA 序列分析確定菌株YP 4-1-1 為清酒乳桿菌。在體外共培養(yǎng)試驗(yàn)中，菌株YP 4-1-1可減弱嗜水氣單胞菌多種毒力因子的表達(dá)。本文從傳統(tǒng)發(fā)酵食品以及海水魚(yú)腸道中獲得對(duì)革蘭氏陰性菌AHLs 具有降解活性的乳酸菌菌株，為控制由AHLs 介導(dǎo)的革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)機(jī)制研究提供借鑒與參考，也為實(shí)現(xiàn)通過(guò)群體感應(yīng)淬滅作用控制革蘭氏陰性菌導(dǎo)致的疾病提出一條新的思路。

圖7 菌株YP 4-1-1 的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.7 The phylogenetic tree for sequences of strain YP 4-1-1