銀小倩 梁梅芳 李鶴賓 姜澤東，2，3 倪 輝，2，3 朱艷冰，2，3*

（1 集美大學食品與生物工程學院 福建廈門361021 2 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室 福建廈門361021 3 廈門南方海洋研究中心經(jīng)濟海藻資源化利用與深加工重點實驗室 福建廈門361021 4 廈門醫(yī)學院 福建廈門361023）

昆布多糖又稱海帶多糖、褐藻淀粉，為海洋褐藻的重要貯藏多糖，約占褐藻干重35%[1-2]。昆布多糖是一種水溶性多糖，是自然界常見的β-1，3-葡聚糖之一，含有部分β-1，6 支鏈[3]。昆布多糖及其衍生物具有廣泛的生物學活性，是一種功能性多糖，在抗腫瘤，改善血脂濃度，早中期腎衰竭防治等方面均有研究報道[4-5]。

β-1，3-葡寡糖可以提高機體免疫力[6]，調(diào)節(jié)腸道菌群[7]，用于糖尿病治療[8]，具有抗腫瘤活性[9]。酶解法生產(chǎn)β-1，3-葡寡糖特異性強，無副產(chǎn)物生成，被認為是有效、安全的低聚寡糖生產(chǎn)方法。昆布多糖酶（EC 3.2.1.39）是一種專一性水解β-1，3-葡聚糖中的β-1，3 糖苷鍵的酶類[10]，它能夠?qū)⒕厶撬馍晒烟?。除了用于制備寡糖，?1，3-葡聚糖酶還可作為添加劑或生物活性多糖的改良劑應用于飼料和釀酒工業(yè)中[11-13]。作為處理酵母細胞的工具酶，應用于原生質(zhì)體制備、細胞融合、基因?qū)牒偷鞍踪|(zhì)提取等方面[14-15]。β-1，3-葡聚糖酶可有效提高植物的抗病能力[16]。除此之外，β-1，3-葡聚糖酶在植物生物質(zhì)降解中發(fā)揮重要作用[17]。

昆布多糖酶來源于廣泛，包括細菌、真菌、植物等，其中微生物是該酶的重要來源。目前報道的產(chǎn)昆布多糖酶的微生物主要包括強烈熾熱球菌（Pyrococcus furiosus）[18]、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis sp.）[19]、海洋紅嗜熱菌（Rhodothermus marinus）[20]、鹽屋鏈霉菌（Streptomyces sioyaensis）[21]、海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）[22]、食半乳聚糖卓貝爾氏黃桿菌（Zobellia galactanivorans）[2]、馬氏鏈霉菌（Streptomyces matensis）[23]、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）[24]等。作者以腐爛海帶為樣品，從中篩選分離出1 株微泡菌（Microbulbifer sp.ALW1）[25]，該菌株為產(chǎn)昆布多糖酶微生物。本文研究微泡菌ALW1 昆布多糖酶粗酶的酶學性質(zhì)及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，為昆布多糖酶和昆布低聚糖的進一步開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細菌學蛋白胨、LB 瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母粉，生工生物工程（上海）股份有限公司；昆布多糖，源葉生物；其它試劑均為分析純產(chǎn)品。

培養(yǎng)基：（1）種子培養(yǎng)基：0.5% 蛋白胨，0.1%酵母粉，0.2% K2HPO4·3H2O，0.1% MgSO4·7H2O，3% NaCl，0.5%（NH4）2SO4，0.001% FeSO4·7H2O，pH 7.5；（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5% 昆布多糖，0.2%K2HPO4·3H2O，0.1% MgSO4·7H2O，3% NaCl，0.5%（NH4）2SO4，0.001% FeSO4·7H2O，pH 7.5。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；ALP 全自動滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；ZHWY-2102/ZWY-200D雙層全溫度培養(yǎng)搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；冷凍高速離心機，德國Eppendorf 公司；FE20 pH 計，梅特勒-托利多稱重設備系統(tǒng)有限公司；恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；PS301F 電子天平，賽多利斯科學儀器；Epoch2T 微量酶標儀，美國伯騰公司；MLX201 小型臺式高速離心機，美國精騏公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 昆布多糖酶粗酶液的制備 菌株接種于種子培養(yǎng)基，25 ℃、180 r/min 搖動培養(yǎng)30 h。以2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，25 ℃、180 r/min 發(fā)酵72 h。發(fā)酵液于4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，取上清液，獲得昆布多糖粗酶液，用于后續(xù)的酶學性質(zhì)研究及酶解產(chǎn)物制備。

1.3.2 昆布多糖酶的活力測定 取5 μL 含0.5%昆布多糖的50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 8.0），加入395 μL 昆布多糖酶，35 ℃反應15 min 后，沸水浴中滅活2 min，加入400 μL DNS 試劑，沸水浴10 min，流水冷卻至室溫后于波長540 nm 處測定反應液的吸光值。通過制作葡萄糖標準曲線確定還原糖含量，由此計算昆布多糖酶的活力。昆布多糖酶活力定義為：在上述條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol 還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.3.3 昆布多糖酶的酶學性質(zhì)研究

1.3.3.1 溫度對昆布多糖酶活性的影響 分別在不同溫度下測定昆布多糖酶酶活力，將最高酶活力定義為100%，研究酶的最適反應溫度。將昆布多糖酶分別在不同溫度中溫浴1 h 后，測定酶的殘余活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，研究酶的溫度穩(wěn)定性。

1.3.3.2 pH 對昆布多糖酶活性的影響 在不同pH 緩沖液中測定昆布多糖酶的活力，將最高酶活力定義為100%，研究酶的最適反應pH。所用緩沖液為50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6.0～8.0），50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0～9.0），50 mmol/L Gly-NaOH 緩沖液（pH 9.0～11.0）。將昆布多糖酶分別置于不同pH 緩沖液中25 ℃溫浴1 h 后，測定酶的殘余活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%，研究酶的pH 穩(wěn)定性。

1.3.3.3 金屬離子對昆布多糖酶活性的影響 分別添加終濃度為1 mmol/L 和10 mmol/L 的不同金屬離子，25 ℃溫浴1 h 后，測定昆布多糖酶的活力，以不加金屬離子的酶活力為100%，研究金屬離子對酶活性的影響。

1.3.3.4 昆布多糖酶動力學參數(shù)測定 分別配制質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL 的昆布多糖溶液，將5 μL 的酶液與395 μL 不同底物濃度的昆布多糖溶液混合，分別于最適溫度35 ℃下溫浴15 min 后取出，于沸水浴滅活2 min，加400 μL DNS，沸水浴10 min，測定酶活力。

1.3.4 昆布多糖酶酶解產(chǎn)物的制備 在50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 8.0）中配制含2 mg/mL 昆布多糖的底物溶液，每100 mL 底物溶液中加入650 U 昆布多糖酶，混勻，在35 ℃條件下進行反應，每隔1 h 取樣一次，測定其還原糖的釋放量，反應10 h 后，將100 U 昆布多糖酶加入到反應混合物中，并在相同溫度下反應2 h，經(jīng)測定，此時還原糖的含量沒有改變。沸水浴加熱10 min 滅活酶蛋白，完全冷卻沉降，10 000 r/min 離心15 min，除去不溶物，將酶解產(chǎn)物冷凍干燥至粉末后備用。

1.3.5 酶解產(chǎn)物的抗氧化活性 參考Wu等[26]的方法，對酶解產(chǎn)物清除ABTS 自由基、·OH 自由基的能力以及酶解產(chǎn)物的還原能力進行測定。

1.4 統(tǒng)計分析

每組試驗數(shù)據(jù)設置3 次平行試驗，應用Excel軟件計算平均值，SPSS Statistics17.0 軟件對結果進行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 溫度對昆布多糖酶活性的影響

在不同溫度下測定菌株ALW1 昆布多糖酶的活力，結果（圖1a）顯示，昆布多糖酶的最適反應溫度為45 ℃。酶的溫度穩(wěn)定性分析（圖1b）顯示，昆布多糖酶在35 ℃下較為穩(wěn)定，溫浴1 h 仍具有約80%的相對酶活力；在40 ℃下溫浴1 h，酶仍具有70%以上的相對酶活力；在50 ℃下處理1 h，酶活力基本喪失，說明高溫對該酶的穩(wěn)定性影響較大。

圖1 溫度對昆布多糖酶活性（a）及熱穩(wěn)定性（b）的影響Fig.1 Effects of temperature on activity（a）and thermostability（b）of laminarinase

2.2 pH 對昆布多糖酶活性的影響

圖2 pH 對昆布多糖酶活性（a）及pH 穩(wěn)定性（b）的影響Fig.2 Effects of pH on activity（a）and thermostability（b）of laminarinase

在不同pH 條件下測定昆布多糖酶的活力，結果（圖2a）顯示，昆布多糖酶在pH=5.5 時，酶的活性最高，因此昆布多糖酶的最適pH 為5.5。酶的pH 穩(wěn)定性分析（圖2b）顯示，昆布多糖酶在pH 6.0～8.0 條件下較為穩(wěn)定，處理1 h 仍然具有60%以上的相對酶活力；當pH<6.0，以及pH>8.0 時，酶活力損失較大，較不穩(wěn)定；當pH<4.0，以及pH>10.0 時，酶幾乎完全失活，說明偏酸或偏堿的環(huán)境都不利于酶活力的保持。

2.3 金屬離子對昆布多糖酶活性的影響

金屬離子對昆布多糖酶活性的影響結果如表1所示，Na+對酶活力起促進作用；K+，F(xiàn)e2+，Cu2+，Co2+，Mn2+，Ba2+，Cd2+和Zn2+對昆布多糖酶具有不同程度的抑制作用，其中Zn2+的抑制作用最強；Ca2+和Mg2+在低濃度（1 mmol/L）時對酶活力沒有影響，在高濃度（10 mmol/L）時對酶有抑制作用。

表1 金屬離子對昆布多糖酶活性的影響Table 1 Effects of metal ions on the activity of laminarinase

2.4 昆布多糖酶的動力學參數(shù)

通過測定不同底物濃度下的反應速度，可以確定酶催化最大反應速率Vmax、米氏方程底物親和常數(shù)Km。如圖3所示，以1/V 為縱坐標，1/[S]為橫坐標，采用Linewaeaver-Burk 作圖法，可得：酶的Km為0.612 mg/mL，Vmax為4.902 U/mg。

圖3 昆布多糖酶Linewaeaver-Burk 雙倒數(shù)擬合曲線Fig.3 Linewaeaver-Burk plot of laminarinase

2.5 昆布多糖酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

2.5.1 酶解產(chǎn)物對ABTS 自由基的清除能力 菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物對ABTS 自由基的清除結果如圖4所示，在分析的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物對ABTS 自由基的清除能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增強，當質(zhì)量濃度為15 mg/mL時，其清除率約為50%。由此可見，菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物對ABTS 自由基具有一定的清除能力，對該自由基的半抑制劑量IC50為15.2 mg/mL。

圖4 酶解產(chǎn)物對ABTS 自由基的清除作用Fig.4 ABTS radical scavenging activity of enzymatic hydrolysates

2.5.2 酶解產(chǎn)物對·OH 自由基的清除能力 菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物對·OH 自由基的清除結果如圖5所示，酶解產(chǎn)物對·OH 自由基的清除能力隨著其質(zhì)量濃度的增大而增強。當質(zhì)量濃度大于3 mg/mL 時，清除能力增強變緩，當質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，清除率達到了80%。由此可見，菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物對·OH 自由基具有一定的清除能力，對該自由基的半抑制劑量IC50為1.7 mg/mL。

2.5.3 酶解產(chǎn)物的還原能力 菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物的還原能力如圖6所示，在分析的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物的還原能力隨其質(zhì)量濃度的增大而增強，其還原能力與質(zhì)量濃度基本成正比關系，表明菌株ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物具有一定的還原能力。

圖5 酶解產(chǎn)物對·OH 自由基的清除作用Fig.5 ·OH radical scavenging activity of enzymatic hydrolysates

圖6 酶解產(chǎn)物的還原能力Fig.6 Reducing capacity of enzymatic hydrolysates

3 結論

通過對微泡菌ALW1 昆布多糖酶一系列酶學性質(zhì)的研究可得：昆布多糖酶的最適反應溫度為45 ℃，在35 ℃下較為穩(wěn)定；酶的最適反應pH 為5.5，在pH 6.0～8.0 范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。金屬離子Na+對酶活力起促進作用，隨著Na+濃度的增大，對酶活力的促進作用增強；Fe2+，Cd2+和Zn2+對昆布多糖酶有強烈的抑制作用。昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物對ABTS 自由基和·OH 自由基的半抑制劑量IC50分別為15.2 mg/mL 和1.7 mg/mL，此外酶解產(chǎn)物具有較強的還原能力。因此，海洋細菌ALW1 昆布多糖酶的酶解產(chǎn)物具有抗氧化活性。