尤義鵬，聶 林，劉晉彪，豐亞輝，魯 桂

（中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006）

流感嚴(yán)重威脅人類健康，目前主要通過流感疫苗和藥物對流感進(jìn)行預(yù)防和治療.流感病毒亞型較多，容易發(fā)生變異，疫苗的開發(fā)與生產(chǎn)需要時(shí)間較長.因此，防治流感的藥物的研究、開發(fā)受到全球范圍的高度重視.神經(jīng)氨酸酶是流感病毒的重要糖蛋白，在流感病毒復(fù)制和傳播中發(fā)揮著重要作用，也是設(shè)計(jì)抗流感病毒藥物的重要靶點(diǎn)［1，2］.目前，已有4個(gè)神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物上市，分別是葛蘭素史克公司的扎那米韋（Zanamivir）［3，4］、羅氏公司的奧司他韋（Oseltamivir）［5，6］、日本的帕拉米 韋（Peramivir）［7，8］和拉尼米韋（Laninamivir）.這些藥物通過模擬唾液酸在神經(jīng)氨酸酶中的氧鎓離子中間體設(shè)計(jì)并經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾得到，盡管母環(huán)結(jié)構(gòu)有所不同，但均含有羧基、乙酰氨基、氨基或胍基、脂肪側(cè)鏈等官能團(tuán)，均以相似的方式與神經(jīng)氨酸酶結(jié)合.Scheme 1示出了上述4種藥物及扎那米韋前體藥4-氨基-2，4-脫氧-2，3-脫氫-N-乙酰基神經(jīng)氨酸（4-氨基DANA）的結(jié)構(gòu).

Scheme 1 Structures of known neuraminidase inhibitors

神經(jīng)氨酸酶的活性中心可以分成5個(gè)區(qū)域，其中S2，S4和S5區(qū)域存在一個(gè)較大的疏水口袋［9］.Fang等［10，11］發(fā)現(xiàn)，將扎那米韋和奧司他韋的羧基換成磷酸類基團(tuán)可獲得活性更優(yōu)的化合物，且化合物的口服利用度得到顯著提高.

本文對上市藥物扎那米韋、奧司他韋和帕拉米韋進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，將化合物相應(yīng)的氨基進(jìn)行磷?；?，設(shè)計(jì)合成了新衍生物I-1～I(xiàn)-10（Scheme 2）.研究了其合成方法，并在激酶水平與細(xì)胞水平考察了新化合物的抗病毒活性.

Scheme 2 Structures of designed new phosphorylated derivatives

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

唾液酸（純度98%）、氯化亞砜（SOCl2，純度99.5%）、碳酸氫鈉（NaHCO3，純度99.8%）、亞磷酸二乙酯（純度99%）、亞磷酸二異丙酯（純度98%）和亞磷酸二苯酯（純度80%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-二甲氨基吡啶（DMAP，純度99%）購于Alfa Aesar公司；疊氮磷酸二苯酯（DPPA，純度97%）和亞磷酸二丁酯（純度96%）購于Sigma Aldrich公司；1，8-二氮雜雙環(huán)［5.4.0］十一碳-7-烯（DBU，純度98%）購于北京百靈威科技有限公司；奧司他韋（純度97%）購于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；硫酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購于廣州澤元貿(mào)易有限公司.所用溶劑均為分析純，試劑除特殊說明外均未經(jīng)純化直接使用，溶劑按常規(guī)方法處理純化.硅膠（200～300目），青島海洋化工公司；C18硅膠，北京慧德易科技有限責(zé)任公司；HSGF254型薄層層析（TLC）硅膠板，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；用紫外燈、碘缸、高錳酸鉀顯色劑和2，4-二硝基苯肼（DNP）顯色劑等檢測.

Bruker Avance 400型核磁共振波譜（NMR）儀，德國Bruker公司，除特殊說明外，以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)；島津LCMS-IT-TOF型離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，日本島津公司；Agilent 6120型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）儀，美國Agilent公司；Perkin Elmer 341型自動旋光儀，美國Perkin Elmer公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

扎那米韋前體A及其C4位氨基磷?；衔颕-1～I(xiàn)-6、奧司他韋C5位氨基磷?；衔颕-7～I(xiàn)-9和帕拉米韋前體C4位氨基磷?；衔颕-10的合成路線見Scheme 3～Scheme 6.

Scheme 3 Synthetic route of Zanamivir precursor A

Scheme 4 Synthetic routes of compounds I-1—I-6

Scheme 5 Synthetic routes of compounds I-7—I-9

Scheme 6 Synthetic route of compound I-10

1.2.1 扎那米韋前體A的合成 參照文獻(xiàn)［12～16］方法合成扎那米韋前體A.將3.85 g（16.2 mmol）唾液酸1加入60 mL MeOH中，0℃下緩慢滴加2.4 mL（32.4 mmol）SOCl2，室溫下攪拌反應(yīng)24 h；在冰浴條件下，向反應(yīng)體系中加入6.0 g NaHCO3粉末，攪拌至無氣泡產(chǎn)生，析出大量白色沉淀；抽濾、洗滌濾餅，旋轉(zhuǎn)蒸干濾液得到白色固體化合物2粗產(chǎn)物8.5 g（產(chǎn)率99%）.將化合物2溶解在20 g（20 mL）吡啶中，加入0.14 g（1.1 mmol）DMAP，0℃下緩慢滴加11.6 g（10.6 mL）Ac2O，室溫下攪拌反應(yīng)24 h；依次使用1 mol/L HCl、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉溶液洗滌，合并有機(jī)相，脫除溶劑后得7.2 g化合物3粗產(chǎn)物.將450 mmol（45 mL）化合物3溶解在Ac2O中，0℃下逐滴加入5.95 g（60.75 mmol）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的H2SO4，滴加完畢于室溫下攪拌反應(yīng)24 h；然后加入飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH=8，用EA萃取，合并有機(jī)相，脫除溶劑柱層析，分離得到4.1 g化合物4，產(chǎn)率60%.將1.5 g（3.48 mmol）化合物4放入燒瓶中，充入氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入30 mL無水甲苯和1.0 mL（4.64 mmol）DPPA，加熱使其完全溶解，0℃冰浴下逐滴加入0.69 mL（4.64 mmol）DBU，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應(yīng)液，經(jīng)柱層析分離得到1.45 g化合物5，產(chǎn)率91%. 將1.45 g（3.18 mmol）化合物5加入80 mL THF和3.7 g（206.5 mmol）H2O的混合溶液中，加入2.1 g（7.94 mmol）PPh3，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于室溫反應(yīng)24 h；反應(yīng)完成后，用CH2Cl2萃取，合并有機(jī)相，脫除溶劑后柱層析分離得到1.24 g扎那米韋前體A，產(chǎn)率91%.

1.2.2 扎那米韋衍生物的合成 參照文獻(xiàn)［17～19］方法合成扎那米韋衍生物.在0℃下，將138 mg（1 mmol）亞磷酸二乙酯溶于3 mL四氯化碳中，10 min后慢慢加入1 mL三乙胺和100 mg（0.2 mmol）扎那米韋前體A的混合物，于0℃反應(yīng)1 h；待反應(yīng)完全后，經(jīng)柱層析分離得到中間體B，產(chǎn)率88%.將中間體B溶于1 mL 1 mol/L NaOH和1 mL THF的混合溶液中，常溫下攪拌12 h；反應(yīng)完全后，加入陽離子交換樹脂調(diào)節(jié)溶液pH值至弱酸性，過濾除去樹脂，旋干濾液得化合物I-1.化合物I-2和I-4的合成分別以亞磷酸二異丙酯和亞磷酸二正丁酯為原料，操作步驟同化合物I-1的合成.以亞磷酸二苯酯為原料得到中間體B，再通過不同的反應(yīng)體系（NaOH/MeOH或NaOH/THF），水解得到相應(yīng)的化合物I-3，I-5和I-6.

1.2.3 奧司他韋衍生物的合成 在0℃下，將亞磷酸二乙酯溶于四氯化碳中，緩慢加入三乙胺和奧司他韋的混合物，于0℃反應(yīng)1 h；待反應(yīng)完全后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應(yīng)液，經(jīng)柱層析分離得到相應(yīng)中間體D，產(chǎn)率56%.將中間體D溶于1 mol/L NaOH和THF的混合溶液中，常溫下攪拌12 h；反應(yīng)完全后，加入陽離子交換樹脂調(diào)節(jié)溶液pH值至弱酸性，過濾除去樹脂，柱層析分離得化合物I-7.以亞磷酸二苯酯為原料得到中間體D，再通過不同的反應(yīng)體系（NaOH/MeOH或NaOH/THF）水解，得到相應(yīng)的化合物I-8和I-9.

1.2.4 帕拉米韋衍生物的合成 參照［20，21］文獻(xiàn)方法制備帕拉米韋前體E.將亞磷酸二乙酯溶于四氯化碳中，緩慢加入三乙胺和帕拉米韋前體E的混合物，于0℃反應(yīng)1 h；待反應(yīng)完全后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應(yīng)液，經(jīng)柱層析分離得到F，產(chǎn)率56%.將化合物F溶于1 mol/L NaOH和THF的混合溶液中，常溫下攪拌12 h；反應(yīng)完全后，加入陽離子交換樹脂調(diào)節(jié)溶液pH值至弱酸性，過濾除去樹脂，經(jīng)柱層析分離得到目標(biāo)化合物I-10.

化合物I-1～I(xiàn)-10的理化性質(zhì)數(shù)據(jù)列于表1，核磁共振波譜數(shù)據(jù)列于表2.

Table 1 Appearance,yields and HRMS data of compounds I-1—I-10

Table 2 11H NMR,13C NMR and31P NMR data of compounds I-1—I-10*

Continued

1.2.5 化合物與神經(jīng)氨酸酶復(fù)合物的結(jié)合自由能預(yù)測 采用分子動力學(xué)模擬軟件AMBER9，參照文獻(xiàn)［22～24］方法對化合物與神經(jīng)氨酸酶復(fù)合物的結(jié)合自由能進(jìn)行了預(yù)測.

1.2.6 化合物對神經(jīng)氨酸酶的抑制活性實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［25，26］方法進(jìn)行化合物的神經(jīng)氨酸酶抑制活性實(shí)驗(yàn).

1.2.7 化合物的抗病毒活性測試 以甲型流感病毒A/HK/8/68（H3N2）和A/WSN/33（H1N1）為病毒毒株，參照文獻(xiàn)［27，28］方法進(jìn)行化合物的抗病毒活性測試.

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的合成

基于文獻(xiàn)［29～33］報(bào)道，優(yōu)化了扎那米韋前體A的合成路線［12～16］（Scheme 3）. 從唾液酸1出發(fā)，在氯化氫的甲醇溶液中進(jìn)行酯化得到化合物2，該反應(yīng)操作方便，容易控制；化合物2經(jīng)DMAP催化與醋酸酐反應(yīng)得到乙?；a(chǎn)物3；化合物3被濃硫酸氧化成化合物4，該步反應(yīng)選用普通經(jīng)濟(jì)的濃硫酸，反應(yīng)條件溫和，與文獻(xiàn)［32］報(bào)道的三氟甲磺酸三甲基硅酯（TMSOTf）關(guān)環(huán)反應(yīng)法相比有很大改進(jìn)；化合物4經(jīng)DPPA疊氮化得到化合物5，該步反應(yīng)條件溫和，比文獻(xiàn)［29～31］報(bào)道的疊氮化鈉法更適合大規(guī)模生產(chǎn)；化合物5經(jīng)過三苯基膦還原得到關(guān)鍵中間體A，此步反應(yīng)條件溫和，不需要使用鉑碳或鈀碳等貴金屬催化劑，也不會導(dǎo)致環(huán)內(nèi)雙鍵的還原.整條反應(yīng)路線步驟簡單、條件溫和、操作方便且經(jīng)濟(jì)環(huán)保.

在低溫下將相應(yīng)的亞磷酸酯溶于四氯化碳，攪拌后緩慢加入三乙胺和扎那米韋前體A，反應(yīng)完全得到磷?；虚g體B，隨后在堿性條件下水解分別合成了扎那米韋前體C4位磷?；苌颕-1～I(xiàn)-6（Scheme 4）.

從奧司他韋C出發(fā)，將其與相應(yīng)的亞磷酸酯反應(yīng)，得到磷?；虚g體D，隨后在堿性條件下水解分別合成了奧司他韋C5位磷?；苌颕-7～I(xiàn)-9（Scheme 5）.

參照［20，21］文獻(xiàn)方法制備帕拉米韋前體E，再將前體E與相應(yīng)的亞磷酸酯反應(yīng)，得到磷?；虚g體F，最后在堿性條件下水解得到帕拉米韋前體C4位磷?；苌颕-10（Scheme 6）.

2.2 化合物與神經(jīng)氨酸酶復(fù)合物的結(jié)合自由能預(yù)測

采用分子動力學(xué)模擬軟件AMBER9對部分新化合物進(jìn)行了活性預(yù)測［22～24］.結(jié)果顯示，新化合物I-1，I-6和I-7與神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合自由能分別為?100.05，?143.87和?105.65 kJ/mol，均小于奧司他韋與神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合自由能（?93.01 kJ/mol），表明抗病毒活性可能會優(yōu)于奧司他韋.

2.3 目標(biāo)化合物對神經(jīng)氨酸酶的抑制活性

分別選擇野生型H1N1神經(jīng)氨酸酶（sH1N1 Neuraminidase，R&D Systems）和突變型H1N1神經(jīng)氨酸酶（rH1N1 Neuraminidase，R&D Systems），以（4-甲基傘形酮）-N-乙?；?α-D-神經(jīng)氨酸鈉鹽（MUNANA）為底物，奧司他韋為陽性對照，采用熒光法測定了化合物對神經(jīng)氨酸酶（NA）的抑制活性，結(jié)果列于表3.可見，所有化合物均具有一定的抑制活性，其中化合物I-8對野生型神經(jīng)氨酸酶（NAs），化合物I-5對突變型神經(jīng)氨酸酶（NAr）分別顯示出很好的抑制活性，與陽性藥奧司他韋相當(dāng)，也優(yōu)于扎那米韋C4位氨基未經(jīng)修飾的前體藥4-氨基-DANA（Scheme 1）.

Table 3 Inhibition activities against NAs and NAr enzymes

由表3可見，新化合物對野生型NAs的抑制活性優(yōu)于對突變型NAr的抑制.從化合物I-1到化合物I-4，隨著亞磷酸酯基團(tuán)的增大，抑制活性逐漸下降，說明亞磷酸酯附近的位阻會影響抑制作用；化合物I-6對NA的抑制活性不如化合物I-5，可能原因是化合物I-5的苯環(huán)有一定的疏水性，可以和NA的S2區(qū)域的疏水口袋結(jié)合，從而增強(qiáng)了活性.另外，NA的S2區(qū)域是由酸性氨基酸組成的負(fù)電荷區(qū)域，化合物I-6的亞磷酸基團(tuán)顯酸性，不利于與NA的結(jié)合.綜上，3類不同骨架的磷?；苌颕-1～I(xiàn)-6，I-7～I(xiàn)-9及I-10對野生型NAs均有較好的抑制作用.

2.4 目標(biāo)化合物的抗流感病毒活性

選取部分新化合物進(jìn)行了抗流感病毒實(shí)驗(yàn).以犬腎上皮細(xì)胞（MDCK）為病毒宿主，奧司他韋為陽性對照藥，測定樣品抑制病毒引起細(xì)胞病變程度（CPE），結(jié)果列于表4.可見，新化合物對流感病毒均具有一定的抑制作用，化合物I-5，I-6，I-9和I-10顯示出更強(qiáng)的抑制活性.新化合物對甲型流感病毒A/HK/8/68（NA亞型為H3N2，病毒對NA和M2離子通道均敏感）的體外抑制活性優(yōu)于對甲型流感病毒A/WSN/33（NA亞型為H1N1，病毒對NA敏感，對M2離子通道耐受），說明化合物對H3N2型流感病毒有更好的選擇性，且對M2離子通道敏感型流感病毒的抑制效果更好.化合物I-6對流感病毒A/HK/8/68的IC50值為0.121 μmol/L，與陽性對照藥奧司他韋相當(dāng)，優(yōu)于扎那米韋前體藥4-氨基-DANA.

Table 4 In vitro anti-influenza virus activities in MDCK cells using the CPE protection assay

3 結(jié) 論

基于現(xiàn)有的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑，結(jié)合亞磷酸基團(tuán)的抗流感活性，分別對扎那米韋C4位、奧司他韋C5位及帕拉米韋C4位氨基進(jìn)行磷酰化，設(shè)計(jì)合成了10個(gè)新衍生物.初步生物活性測試結(jié)果表明，新化合物I-1～I(xiàn)-10對流感病毒神經(jīng)氨酸酶均有一定的抑制活性，在細(xì)胞水平的測試中也表現(xiàn)出一定的病毒抑制活性，尤其是化合物I-8在酶水平、化合物I-6在細(xì)胞水平具有和陽性對照藥奧司他韋相當(dāng)?shù)幕钚?