周建萍，余猛進，毛振彪

1解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)（第二軍醫(yī)大學(xué)）第一附屬醫(yī)院急診科，上海200433

2南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化科，江蘇 南通2260010

胃癌是人類最常見的癌癥之一，2012 年胃癌新發(fā)病例近100 萬例，居全球常見惡性腫瘤第五位。70%以上的胃癌病例發(fā)生在發(fā)展中國家，其中一半發(fā)生在東亞（主要是中國）。胃癌是全球男性和女性因癌癥死亡的第三大死因，估測中國是世界上胃癌發(fā)病率和病死率最高的國家[1]。胃癌發(fā)病率隨年齡增長而增長顯著，發(fā)病高峰年齡為60～74 歲；然而，目前其在30 歲以下人群中越來越普遍。中國胃癌的發(fā)病率和病死率明顯高于其他國家，預(yù)后普遍較差。2015 年，中國年齡標(biāo)化后的胃癌發(fā)病率和病死率在所有腫瘤中居第二位。人口增長和老齡化導(dǎo)致大量新發(fā)病例，幽門螺桿菌感染可能會導(dǎo)致胃癌發(fā)生[2]。近幾十年來，已報道大量的微小RNA（microRNA，miRNA）與胃癌有關(guān)。miRNA 主要通過抑制靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）翻譯或mRNA 降解參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。最近的研究表明，miRNA可能作為潛在的致癌基因或抑癌基因在人類癌癥中發(fā)揮重要作用[4]。miRNA 是由18～24 個核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA，結(jié)合在與之互補的mRNA 3'非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）或5'UTR，與蛋白質(zhì)因子形成RNA 沉默復(fù)合物，導(dǎo)致mRNA 降解或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[5]。miRNA 調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡，其異常表達(dá)促進細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腫瘤血管生成[6]。真核生物miRNA 調(diào)節(jié)mRNA，大量證據(jù)表明人類癌癥中miRNA 突變或欠表達(dá)，提示miRNA可能為腫瘤致癌基因或抑癌基因[7]。本研究使用miRNA-9 轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株，并分別采用CCK-8和Transwell 法檢測胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株MKN-45 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；根據(jù)Geen Bank 提供的miRNA-9 序列，miRNA-9 質(zhì)粒由上海吉瑪公司合成。CCK-8 試劑盒購自beyotime 公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM、RPM1640 培養(yǎng)基均購自Hyclone 公司；無內(nèi)毒素的少量質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega 公司；Lipofectamine 2000 試劑盒購自invitrogen 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

常規(guī)培養(yǎng)傳代，取傳代2、3 次且生長良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×106/ml 接種到6 孔培養(yǎng)板無抗完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。預(yù)實驗確定250 ml 無血清培養(yǎng)基稀釋4.0 mg DNA，8 ml Lipofectamine 2000稀釋250 ml無血清培養(yǎng)基，二者混合后總體積500 ml。將脂質(zhì)體和DNA 混合物逐滴加入到每孔中，充分混勻。37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育6 h，更換培養(yǎng)基，MKN-45 細(xì)胞株加入混合物48 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.3 質(zhì)粒抽提

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，搖菌，質(zhì)粒小量抽提，制備質(zhì)粒的過程即裂解細(xì)菌、分離、收集、純化質(zhì)粒的過程。先用強熱或酸、堿等化學(xué)物質(zhì)破壞細(xì)胞壁，使細(xì)菌染色體DNA 變性并纏繞附著在細(xì)胞碎片上或被切斷成不同大小的線性片斷。外界條件恢復(fù)正常時，線狀染色體DNA 片段難以復(fù)性，而質(zhì)粒DNA 雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，溶解在液相中，再通過樹脂吸附等方法將其分離。使用無內(nèi)毒素的少量質(zhì)粒抽提試劑盒獲得，具體操作步驟按照說明書進行。

1.4 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖

實驗分為4 組：miRNA-9 類似物組、miRNA-9抑制物組、陰性對照組、空白對照組（MKN-45 細(xì)胞加新鮮的DMEM培養(yǎng)基）。取MKN-45細(xì)胞株對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml 接種至6 孔板，次日長滿，分別將miRNA-9類似物、miRNA-9抑制物、陰性對照質(zhì)粒按照Lipofectamine 2000 說明書轉(zhuǎn)染MKN-45 細(xì)胞株。12 h 后胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2×103/ml 細(xì)胞懸液接種至96 孔板，無抗完全培養(yǎng)液定容至每孔100 ml，于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。調(diào)零組為無抗完全培養(yǎng)液，每組設(shè)6 個復(fù)孔，分別在24、48、72 h 測定吸光度，測定前避光加CCK-8 每孔10 ml，37 ℃5%CO2培養(yǎng)2 h，終止培養(yǎng)，酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm 波長下的吸光度，去掉極端值，實驗重復(fù)3 次，取均值。

1.5 Transwell 法檢測細(xì)胞遷移

制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度1×105/ml。取MKN-45 細(xì)胞懸液200 ml 接種于Transwell 小室。24 孔板下室加入600 ml 含20%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h。結(jié)果統(tǒng)計使用直接計數(shù)法，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用PBS 清洗2 遍，甲醇固定30 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色固定20 min，棉簽輕輕擦掉小室上層未遷移細(xì)胞，PBS 清洗3遍。100 倍倒置顯微鏡下隨機選取5 個視野觀察細(xì)胞。實驗重復(fù)3 次，取均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用重復(fù)測量方差分析，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株MKN-45 的效率測定

使 用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn) 染，轉(zhuǎn) 染48 h 后MKN-45 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%（圖1），細(xì)胞損傷最低，轉(zhuǎn)染時間過久，易出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。

圖1 陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌MKN-45細(xì)胞株（×100）

2.2 質(zhì)粒檢測

質(zhì)粒DNA 濃度和純度測定吸光度值A(chǔ)260∶A280=1.8～1.9，如高于此范圍，說明有殘余蛋白質(zhì)存在，低于此范圍提示混有RNA。2%瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)粒DNA 以3 種形式存在，即環(huán)狀DNA、線狀DNA、超螺旋DNA。miRNA-9 質(zhì)粒分子量為5702 bp，質(zhì)粒電泳說明提取質(zhì)粒符合實驗要求。

2.3 miRNA-9 對MKN-45 細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染48、72 h 時計算細(xì)胞增殖率，miRNA-9 類似物組細(xì)胞增殖率分別為（60.233±4.366）%、（114.063±1.730）%，miRNA-9 抑制物組細(xì)胞增殖率分別為（22.216±5.583）%、（59.637±8.542）%。結(jié)果顯示miRNA-9 類似物組細(xì)胞增殖率高于陰性對照組和空白對照組（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同時間點各組MKN-45 細(xì)胞的增殖率（%±s）

表1 不同時間點各組MKN-45 細(xì)胞的增殖率（%±s）

組別miRNA-9類似物組miRNA-9抑制物組陰性對照組空白對照組轉(zhuǎn)染24 h 6.045±5.363 12.309±7.326 10.520±8.061 8.5678±6.735轉(zhuǎn)染48 h 60.233±4.366 22.216±5.583 25.742±7.835 40.756±7.876轉(zhuǎn)染72 h 114.063±1.730 59.637±8.542 72.764±15.698 90.333±14.395

2.4 miRNA-9 對MKN-45 細(xì)胞遷移的影響

分別計數(shù)轉(zhuǎn)染48 h 后各組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示miRNA-9 類似物組穿膜細(xì)胞數(shù)為（1052±71）個，miRNA-9 抑制物組為（276±32）個，陰性對照組為（595±42）個，空白對照組為（613±35）個，miRNA-9 類似物組穿膜細(xì)胞數(shù)較空白對照組、陰性對照組增多。（圖2）

圖2 Transwell遷移實驗觀察各組MKN-45細(xì)胞的遷移能力（結(jié)晶紫染色，×100）

3 討論

癌癥是由致癌基因、抑癌基因和miRNA 改變而引起的[8]。腫瘤相關(guān)基因的異常調(diào)節(jié)、基因增加或缺失、異常的蛋白質(zhì)翻譯導(dǎo)致致癌基因過表達(dá)和抑癌基因下調(diào)[9]。miRNA 的異常表達(dá)促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腫瘤血管生成；miRNA存在于不同腫瘤亞型，如結(jié)腸癌、胃癌等。胃癌組織通過miRNA 簇抑制細(xì)胞周期[10]。本研究以miRNA-9 為研究對象，研究焦點集中在預(yù)測靶基因和相關(guān)的miRNA。

miRNA-9 有3 種亞型，即miRNA-9-1、miRNA-9-2、miRNA-9-3；根據(jù)Gene Bank 可知它們都有CpG 島，其成熟體序列一樣，功能相似。在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)其DNA 高度甲基化導(dǎo)致表達(dá)降低[11]。Tsai 等[12]研究表明，miRNA-9 是胃癌的抑癌基因，5-Aza-dC 去甲基化處理增加了miRNA-9 的表達(dá)，可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和浸潤。Wan 等[13]發(fā)現(xiàn)miRNA-9 在人胃腺癌組織中表達(dá)降低，miRNA-9過表達(dá)明顯抑制人胃癌細(xì)胞株和裸鼠腫瘤生長，miRNA-9 抑制核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）mRNA 和蛋白表達(dá)，提示其作為腫瘤抑癌基因發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-9 后，miRNA-9 對MKN-45 胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為有顯著影響。CCK-8 和Transwell 檢測顯示，過表達(dá)miRNA-9 可促進胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，而下調(diào)miRNA-9則降低胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，表明miRNA-9在MKN-45 細(xì)胞中起致癌基因的作用。miRNA-9表達(dá)在其他腫瘤中上調(diào)，表明其作用可能與致癌基因類似。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，miRNA-9 抑制E-鈣黏蛋白表達(dá)，抑制miRNA-9 可恢復(fù)E-鈣黏蛋白活性；在E-鈣黏蛋白表達(dá)降低的結(jié)腸癌標(biāo)本中，miRNA-9 表達(dá)顯著增加[14]。此外，miRNA-9 上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中的E-鈣黏蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞遷移和侵襲性。miRNA-9 介導(dǎo)的E-鈣黏蛋白下調(diào)導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）表達(dá)上調(diào)和腫瘤血管生成。此外，在miRNA-9 過表達(dá)的乳腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，在高度惡性細(xì)胞中抑制miRNA-9 可以抑制轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果與以上結(jié)論一致。Gao 等[16]認(rèn)為miRNA-9 在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均低于癌旁組織和未分化胃上皮細(xì)胞，體內(nèi)和體外實驗表明過表達(dá)miRNA-9 可抑制胃癌細(xì)胞和組織的增殖。目前發(fā)現(xiàn)很多未分化胃癌病例，存在胃上皮細(xì)胞內(nèi)miRNA-9 基因突變，因此推測miRNA-9 起雙重作用，也許取決于目標(biāo)靶基因及腫瘤類型。將來將建立動物模型，進一步研究miRNA-9 和靶基因的相關(guān)性。