陳素華，馬天江，張智慧，張磊，史磊

漯河市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 漯河4620000

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率分別居惡性腫瘤第3位和第4位，普遍呈上升趨勢[1]。據(jù)統(tǒng)計，美國平均每年約有40.7/10 萬CRC 新發(fā)病例，死亡14.8/10 萬例，其中男性發(fā)病率和病死率分別高于女性30%和40%[2]。吸煙、酗酒、暴飲暴食、腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡、家族遺傳等是結直腸癌的危險因素，但其發(fā)病機制尚未詳細闡明[3-4]。結直腸癌的臨床治療以腹腔鏡手術、開腹手術等外科手術治療為主，輔以放療、化療、分子靶向治療等，術后總5 年生存率約為50%[5]；但多數(shù)患者術后易復發(fā)轉移，且多數(shù)患者就診時已為晚期，放、化療對患者造成的負擔較大，因此尋找高效低毒的天然化合物輔助治療是目前腫瘤領域研究的熱點之一[6]。山竹（Garcinia mangostana L）為金絲桃科藤黃屬常綠喬木，俗稱山竹子、山竺，主要分布于泰國、馬來西亞等國家及中國海南、廣西、福建等地；在一些東南亞國家，山竹果皮常用于治療痢疾、潰瘍和外傷等[7]。氧雜蒽酮類化合物（xanthones）是山竹果皮的主要化學成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等廣泛的藥理活性[8]。肝癌擴增因子1（amplified in liver cancer 1，ALC1）又稱為染色質解旋酶DNA 結 合 蛋 白1（chromodomain helicase DNA binding protein 1 like，CHD1L），是從人肝癌細胞克隆并分離的新的癌基因，位于染色體1q21 區(qū)[9-10]。ALC1 可編碼89 kD 分子的蛋白，包含一個SNF2-N結構域，屬于SNF2 類家族；能夠與DNA 結合調節(jié)核小體組裝、DNA 修復和染色質重塑[11-12]。ALC1在食管癌、乳腺癌等腫瘤組織中高表達，其表達水平與腫瘤浸潤、淋巴結轉移、腫瘤分期及患者預后具有顯著相關性，敲除ALC1 后，細胞遷移和侵襲能力均明顯降低[13-14]。ALC1 在結直腸癌組織中明顯高表達，參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展[15]。但氧雜蒽酮對結直腸癌進展的影響及其是否通過ALC1 影響結直腸癌的增殖和凋亡還尚未清楚。本研究通過以不同濃度氧雜蒽酮干預SW480 細胞，檢測細胞增殖、凋亡及ALC1 表達，探討氧雜蒽酮對SW480 細胞增殖、凋亡的影響及其可能的作用機制，以期為結直腸癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SW480 細胞購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）；胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)液均購自美國Gibco-BRL 公司；胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher 公司；5-二苯基四氮 唑 溴 鹽（5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）均購自美國Sigma 公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）凋亡檢測試劑盒購自美國Coulter 公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑購自美國Invitrogen 公司；control siRNA、ALC1 siRNA 由山東維真生物科技有限公司設計合成；pcDNA-ALC1 過表達載體由金瑞斯生物科技公司構建；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、電 化 學 發(fā) 光（electrochemiluminescence，ECL）液、Trizol 試劑、RIPA 裂解液均購自北京Solarbio 公司；兔抗B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcell lymphoma/leukemia- 2 associated X protein，BAX）、ALC1、β-actin 抗 體 和 辣 根 過 氧 化 物 酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）均購自美國Abcam 公司；TaKaRa 反轉錄試劑盒、TaKaRa 實時熒光定量試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。CFX96 Touch TM 熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)、Chemi-Doc TM MP 凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad 公司；MCO-18AC 型CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO 公司；Nanodrop ND-2000 超微量核酸蛋白測定儀購自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；HBS-1096B 型酶標儀購自南京德鐵實驗設備公司。

1.2 山竹果皮中總氧雜蒽酮提取物的制備

將山竹果皮洗凈烘干后粉碎，取50 g 山竹果皮粉末溶于500 ml 85%乙醇中，放置過夜（16 h）；過濾收集上清液，旋蒸至約10 ml，用乙酸乙酯萃取，取上清；過硅膠柱后正己烷和乙酸乙酯（5∶1）洗脫，洗脫液烘干后所得干粉用DMSO 溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染

使用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)SW480 細胞。取對數(shù)生長期的細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后收集并重懸，調整細胞懸液濃度為1×105/ml，接種至24 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度約45%，將control siRNA（si-NC 組）、ALC1 siRNA（si-ALC1 組）、pcDNA3.1 空載體和pcDNA-ALC1 過表達載體轉染至SW480 細胞，轉染pcDNA3.1 空載體和pcDNAALC1 過表達載體的細胞置于含400 μmol/L 山竹果皮總氧雜蒽酮的培養(yǎng)液中培養(yǎng)并記為總氧雜蒽酮+pcDNA 組和總氧雜蒽酮+pcDNA-ALC1 組。單獨使用含400 μmol/L 山竹果皮總氧雜蒽酮的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)的細胞記為總氧雜蒽酮組，未作處理的細胞記為對照組。每組6個復孔，實驗重復3次。

1.4 MTT 法檢測細胞增殖

取SW480細胞隨機分為0 μmol/L組、200 μmol/L組、400 μmol/L 組、600 μmol/L 組和800 μmol/L 組；處理方法：在SW480 細胞培養(yǎng)液中加入總氧雜蒽酮，并分別調整終濃度為0、200、400、600、800 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在上述細胞及si-NC組、si-ALC1組、對照組、總氧雜蒽酮組、總氧雜蒽酮+pcDNA組和總氧雜蒽酮+pcDNA-ALC1組細胞培養(yǎng)液中加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl 二甲基亞砜振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm 處吸光度（A）值。藥物對細胞的抑制率=（1-實驗組A 值/對照組A 值）×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取si-NC 組、si-ALC1 組、對照組、總氧雜蒽酮組、總氧雜蒽酮+pcDNA 組和總氧雜蒽酮+pcDNAALC1組細胞，0.25%胰蛋白酶消化，4 ℃、1600 r/min離心收集。按照Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書，分別加入5 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測mRNA 相對表達量

收集對照組、總氧雜蒽酮組細胞，研磨充分后Trizol 法提取總RNA。檢測總RNA 濃度和純度，按照TaKaRa 反轉錄試劑盒說明書將RNA 反轉錄為cDNA，使用TaKaRa 熒光定量試劑盒配制反應體系，以β-actin 為內參進行PCR 擴增，每個RNA 樣品重復3 次。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量，所用引物及序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物及序列

1.7 蛋白質印跡法（Western blot）檢測蛋白表達情況

收集si-NC 組、si-ALC1 組、對照組、總氧雜蒽酮組、總氧雜蒽酮+pcDNA 組和總氧雜蒽酮+pcDNA-ALC1 組細胞，加入RIPA 裂解液置于冰上裂解細胞，4 ℃、23 000 r/min 離心15 min，收集上清液。將蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳后轉至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入兔抗Bcl-2（1∶1000）、BAX（1∶1000）、ALC1（1∶1000）和β-actin（1∶10 000）抗體4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3次，每次10 min；加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5000）室溫孵育2 h，TBST 洗滌；ECL 發(fā)光顯影，每個蛋白樣品重復3 次。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗，兩組間比較采用t 檢驗，以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度總氧雜蒽酮對SW480細胞增殖的影響

MTT 檢測結果表明，不同濃度山竹果皮總氧雜蒽酮均可有效抑制SW480 細胞增殖（P﹤0.05），其增殖抑制率隨總氧雜蒽酮濃度的增加而提高（P﹤0.05）；400 μmol/L 總氧雜蒽酮處理后細胞增殖抑制率接近50%，用于后續(xù)實驗。（表2）

表2 不同濃度總氧雜蒽酮對SW480 細胞增殖抑制率的比較（±s）

表2 不同濃度總氧雜蒽酮對SW480 細胞增殖抑制率的比較（±s）

注：a與0 μmol/L組比較，P<0.05；b與200 μmol/L組比較，P<0.05；c與400 μmol/L組比較，P<0.05；d與600 μmol/L組比較，P<0.05

組別0 μmol/L組200 μmol/L組400 μmol/L組600 μmol/L組800 μmol/L組F值P值增殖抑制率（%）5.6±0.76 23.12±2.13a 48.46±4.11a b 63.74±5.11a b c 78.49±5.04a b c d 179.011 0.000

2.2 總氧雜蒽酮對SW480 細胞凋亡的影響

以400 μmol/L 總氧雜蒽酮干預SW480 細胞，凋亡細胞增多，細胞凋亡率為（25.79±2.11）%，高于對照組的（7.61±0.69）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=14.184，P﹤0.05）。（圖1）

圖1 流式細胞儀檢測對照組與總氧雜蒽酮組細胞凋亡情況

2.3 總氧雜蒽酮對SW480 細胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相對表達量的影響

以400 μmol/L 總氧雜蒽酮干預SW480 細胞后檢測細胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相對表達量。總氧雜蒽酮組SW480 細胞中Bcl-2、ALC1 相對表達量均明顯低于對照組，BAX 相對表達量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。（表3）

表3 對照組與總氧雜蒽酮組SW480 細胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相對表達量的比較（±s）

表3 對照組與總氧雜蒽酮組SW480 細胞中Bcl-2、BAX、ALC1 相對表達量的比較（±s）

組別對照組總氧雜蒽酮組t值P值Bcl-2 mRNA 0.97±0.08 0.58±0.05 7.160 0.002 BAX mRNA 0.66±0.07 1.03±0.06 6.951 0.002 ALC1 mRNA 5.61±0.12 2.97±0.15 23.804 0.000

2.4 總氧雜蒽酮對SW480 細胞中Bcl-2、BAX、ALC1 蛋白表達情況的影響

Western blot 實驗結果顯示，總氧雜蒽酮組SW480 細胞中Bcl-2、ALC1 蛋白表達量均明顯低于對照組，BAX 蛋白表達量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。（圖2、表4）

2.5 敲減ALC1 對SW480 細胞增殖和凋亡的影響

si-ALC1 組SW480 細胞中ALC1 蛋白表達水平明顯低于si-NC 組，細胞增殖抑制率和凋亡率均明顯高于si-NC 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。（圖3、表5）

圖2 Western blot法檢測對照組及總氧雜蒽酮組SW480細胞中Bcl-2、BAX、ALC1蛋白表達情況

表4 對照組與總氧雜蒽酮組SW480 細胞中Bcl-2、BAX、

ALC1 蛋白表達量的比較（±s）

組別對照組總氧雜蒽酮組t值P值Bcl-2蛋白0.53±0.03 0.19±0.02 16.333 0.000 BAX蛋白0.16±0.02 0.47±0.04 12.006 0.000 ALC1蛋白0.86±0.07 0.37±0.04 10.527 0.001

圖3 Western blot檢測si-NC組和si-ALC1組SW480細胞中ALC1蛋白表達情況

表5 si-NC 組和si-ALC1 組SW480 細胞ALC1 蛋白表達量、增殖抑制率及凋亡率的比較（±s）

表5 si-NC 組和si-ALC1 組SW480 細胞ALC1 蛋白表達量、增殖抑制率及凋亡率的比較（±s）

組別si-NC組si-ALC1組t值P值ALC1蛋白0.79±0.08 0.25±0.03 10.947 0.000增殖抑制率（%）6.46±0.67 39.49±3.17 17.657 0.000凋亡率（%）7.13±0.72 21.46±2.24 10.549 0.001

2.6 過表達ALC1 對SW480 細胞增殖和凋亡的影響

總氧雜蒽酮組SW480 細胞中ALC1 蛋白表達水平低于對照組，細胞增殖抑制率和凋亡率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）；而將pcDNA-ALC1 轉染至SW480 細胞進行預處理后，總氧雜蒽酮+pcDNA-ALC1 組SW480 細胞中ALC1蛋白表達水平高于總氧雜蒽酮+pcDNA 組，細胞增殖抑制率和凋亡率均低于總氧雜蒽酮+pcDNA 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（圖4、表6）

圖4 Western blot檢測各組SW480細胞中ALC1蛋白表達情況

表6 各組SW480 細胞ALC1 蛋白表達量、增殖抑制率及凋亡率的比較（±s）

表6 各組SW480 細胞ALC1 蛋白表達量、增殖抑制率及凋亡率的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與總氧雜蒽酮+pcDNA組比較，P<0.05

增殖抑制率（%）7.11±0.68 49.36±4.07a 46.11±4.34 12.76±2.13b 143.573 0.000凋亡率（%）7.98±0.81 28.46±2.11a 24.13±2.09 14.26±1.87b 79.972 0.000組別對照組總氧雜蒽酮組總氧雜蒽酮+pcDNA組總氧雜蒽酮+pcDNA-ALC1組F值P值ALC1蛋白0.82±0.07 0.31±0.03a 0.28±0.02 0.73±0.07b 84.649 0.000

3 討論

隨著生活方式和飲食結構的改變及人口老齡化的加劇，中國結直腸癌發(fā)病率和病死率逐年增高，在2003—2011 年，中國結直腸癌發(fā)病率由12.8/10 萬增加到16.8/10 萬，病死率則由5.9/10 萬上升至7.8/10 萬，嚴重影響居民生活質量[16]。因此，尋找結直腸癌早期預防及改善其臨床療效的有效方法具有重要意義。

山竹是一種藥食同源的水果，其果實富含維生素、蛋白質和礦物質，食用價值較高，素有“水果王后”之稱；其果皮、樹皮及樹根是泰國、印度等國家的傳統(tǒng)藥材，對腹瀉、腹痛、跌打扭傷、傷口感染的治療效果顯著[17]。氧雜蒽酮類化合物、黃酮類化合物是山竹果皮的主要活性成分，其中，氧雜蒽酮能夠抑制乳腺癌、非小細胞肺癌及黑色素瘤的細胞活力，并對細胞凋亡具有促進作用[18]。多項研究表明，氧雜蒽酮能夠通過調節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉導途徑、半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3）信號通路及p38、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等基因表達，抑制腫瘤細胞增殖并誘導凋亡，減少炎性介質的釋放，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用[19-20]。caspase 3是caspase 級聯(lián)反應過程中的關鍵執(zhí)行分子，而Bcl-2 和BAX 位于線粒體上游，當出現(xiàn)凋亡信號刺激時，BAX 由細胞質轉移至線粒體膜上與Bcl-2 結合形成同源二聚體，同時改變線粒體膜通透性，促進細胞色素C 的釋放，進而激活caspase 3，啟動caspase 級聯(lián)反應[21]。而氧雜蒽酮能夠使多種腫瘤細胞周期停滯，同時促進細胞凋亡[22]。為研究氧雜蒽酮對結直腸癌細胞增殖和凋亡的影響及潛在作用機制，本研究以SW480 細胞為研究對象，使用不同濃度氧雜蒽酮干預細胞發(fā)現(xiàn)，細胞增殖抑制率濃度依賴性增大；400 μmol/L 氧雜蒽酮可有效促進SW480 細胞凋亡，抑制Bcl-2 表達并上調BAX表達。

李楊等[23]研究發(fā)現(xiàn)，ALC1 在肝癌細胞系中表達上調，采用RNAi 技術沉默ALC1 表達后，細胞增殖能力明顯受到抑制。ALC1 高表達與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展相關，ALC1 高表達的食管鱗狀細胞癌患者總生存率低；ALC1 高表達可增強KYSE30 食管癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力[13]。而在結直腸癌中，已有報道稱，ALC1 蛋白在結直腸癌組織中呈高表達，且ALC1 表達水平與腫瘤浸潤深度、腫瘤大小及分化程度密切相關，上調ALC1 表達能促進結直腸癌細胞增殖、遷移及裸鼠成瘤能力[15]。為研究氧雜蒽酮調控SW480 細胞增殖和凋亡的作用是否與ALC1 有關，本研究以400 μmol/L 氧雜蒽酮處理SW480 細胞后發(fā)現(xiàn)，細胞中的ALC1 mRNA 和蛋白表達水平均顯著下調。提示氧雜蒽酮對SW480 細胞增殖、凋亡的影響可能與ALC1 的低表達有關。為驗證這一猜想，進一步檢測發(fā)現(xiàn)，采用RNAi 技術敲減ALC1 表達后，SW480 細胞增殖抑制率和凋亡率均明顯升高，而過表達ALC1 后氧雜蒽酮對SW480 細胞的增殖抑制和凋亡促進作用均有所減弱。氧雜蒽酮通過抑制Bcl-2 表達并上調BAX 表達而調控SW480 細胞凋亡，且氧雜蒽酮處理會使ALC1 表達下降，敲減ALC1 也能促進細胞凋亡，提示氧雜蒽酮可能通過抑制ALC1、Bcl-2 表達，上調BAX 表達進而影響SW480 細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，氧雜蒽酮可有效抑制SW480 人結直腸癌細胞增殖并誘導凋亡，這一結果可能是通過抑制ALC1 表達完成，有望為結直腸癌的預防及治療提供新思路。