王 璐，朱順海，趙其平，黃 兵，韓紅玉，劉桂玲,2，李志行,2，趙煥之，董 輝

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物寄生蟲學重點實驗室，上海 200241；2. 上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234）

雞球蟲病是由艾美耳屬（Eimeriaspp.）球蟲引起的一種廣泛流行的寄生蟲病，每年給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。目前，控制球蟲病的方法主要是使用抗球蟲藥物或疫苗，但廣泛使用抗球蟲藥已導致雞體產(chǎn)生嚴重的耐藥性[2]，疫苗因成本較高且存在毒力反強等問題而使其使用受限[3]。因此，迫切需要研究新的方法來控制雞球蟲病。柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella）是7種雞艾美耳球蟲中的一員[4]，具有很強的致病力。柔嫩艾美耳球蟲屬于嚴格的細胞內(nèi)專性寄生蟲，有著復雜的生活史，必須依靠宿主細胞才能完成其生活周期。阻止蟲體入侵細胞和在細胞內(nèi)的發(fā)育是預防和控制球蟲病的有效方法。因此，鑒定與蟲體入侵相關(guān)的關(guān)鍵分子將有助于開發(fā)新的抗球蟲藥物和疫苗。

寄生蟲感染細胞是一個復雜的過程，其間宿主細胞會發(fā)生一系列的反應以抵抗寄生蟲的入侵與發(fā)育，同時，蟲體也會調(diào)控宿主細胞的某些機能活動以創(chuàng)造更利于自身發(fā)育和繁殖的條件。已有研究表明，感染鐮形艾美耳球蟲（E. falciformis）后，小鼠上皮細胞中吲哚胺2,3-雙加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase1）的表達會顯著增加，并且這一現(xiàn)象會在寄生蟲感染過程中持續(xù)存在，升高的吲哚胺2,3-雙加氧酶1對維持寄生蟲最佳發(fā)育有重要作用[5]。在微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）的感染過程中，宿主細胞整合素α2（integrin α2）可能作為感染部位F肌動蛋白上游調(diào)控元件的一部分，與蟲體發(fā)生相互作用[6]。以上研究表明，宿主細胞在寄生蟲入侵和細胞內(nèi)發(fā)育中起著不可或缺的作用。目前，艾美耳球蟲入侵宿主細胞機制的研究主要集中在蟲體蛋白上，而與艾美耳球蟲相關(guān)的宿主蛋白研究鮮有報道。

相對和絕對定量同位素標記（iTRAQ）技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)已經(jīng)成為一種強有力的定量蛋白質(zhì)組學方法，與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢，如定量準確、高效率樣品分離、高鑒定率、適用范圍廣等，該技術(shù)已成功應用于探索病毒[7]和細菌[8]與宿主相互作用機制的研究。本研究運用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)，對原代雞胚成纖維（chicken embryo fibroblast，CEF）細胞在柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵72 h后的差異表達蛋白進行了篩選，為深入研究柔嫩艾美耳球蟲與宿主之間的互作關(guān)系提供了重要的基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲株和實驗動物柔嫩艾美耳球蟲上海株（資源編號：CAAS21111611），由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所動物原蟲病團隊保存。三黃雞購自上海某雞場，無球蟲的條件下飼養(yǎng)，飼料和飲水中不添加任何抗球蟲藥物。

1.2 試劑和儀器PBS溶液、DMEM、胰蛋白酶、SDT裂解液購自美國Gibco公司；細胞培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司；Q-Exactive質(zhì)譜儀、Easy nLC1000納升級液相色譜儀購自美國Thermo Finnigan公司；AKTA Purifier 100純化儀購自GE Healthcare；低溫高速離心機、真空離心濃縮儀購自美國Eppendorf公司；可見紫外分光光度計購自尤尼柯公司；600 V電泳儀（GE Healthcare EPS601）購自Manuale公司。

1.3 CEF細胞制備按照Witter等[9]的方法進行CEF細胞的制備，具體步驟為：取10日齡SPF雞胚3只，去除頭、四肢、內(nèi)臟等部分，取肌肉組織，預冷PBS沖洗3次，充分剪碎至肉糜狀，預冷PBS重懸后，3000×g離心10 min，棄上清液，重復此步驟。沉淀用預冷DMEM重懸后，3000×g離心10 min，棄上清液，加入0.25%胰蛋白酶15 mL，37℃消化1 h，期間每20 min震蕩混勻1次。消化后100 μm濾膜過濾，濾液中加入完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1%雙抗）后，3000×g離心10 min，棄上清液，重復1次，用適量完全培養(yǎng)基吹打混勻細胞沉淀后移入細胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 柔嫩艾美耳球蟲卵囊的收集、純化及子孢子的提取1日齡三黃雞在無球蟲的條件下飼養(yǎng)至14日齡后，接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊，每只接種2.0×104個卵囊。收集接種后6～8 d雞糞便中的卵囊，通氧至卵囊孢子化率達90%左右時，用飽和食鹽水飄浮法和次氯酸鈉法對孢子化的卵囊進行純化。在純化好的孢子化卵囊沉淀中加入PBS，用玻璃珠震蕩破壁至卵囊破壁率達到90%，3000×g離心8 min，用HBBS緩沖液重懸沉淀后，轉(zhuǎn)移至錐形瓶內(nèi)，向其中加入0.5%的胰蛋白酶和7%的雞膽汁，吸管輕輕吹打后在41℃水浴鍋中消化約1 h，鏡檢若有大部分子孢子釋放出來時，離心、洗滌，用G3砂芯漏斗純化子孢子。收集濾液，子孢子沉淀用PBS洗滌3次后，計數(shù)。

1.5 入侵實驗CEF細胞（1.5×106個細胞/瓶）接入T25細胞培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基37℃、5%CO2培養(yǎng)至細胞密度80%左右。新鮮子孢子在DMEM（含2%血清、5%雙抗）中37℃、5%CO2孵育2 h，3500×g離心10 min，棄上清液，完全培養(yǎng)基重懸后，按子孢子與細胞2∶1比例接入細胞中，37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h，更換細胞培養(yǎng)液，以洗去未入侵的子孢子，繼續(xù)培養(yǎng)60 h。設置不加入子孢子的細胞為對照組。所有試驗設置3個重復。

1.6 樣品的收集與細胞全蛋白的提取收集子孢子入侵72 h和不入侵的細胞樣品，預冷PBS洗3次，加入SDT（4% SDS、1 mmol/L DTT、150 mmol/L Tris-HCl pH8.0、蛋白酶抑制劑）裂解液，勻漿均勻后，進行超聲和沸水浴裂解，4℃、15 000×g離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度后，低溫保存。

1.7 酶解、肽段定量和標記各取200 μg樣品，加入200 μL UA buffer（8 mol/L尿素，150 mmol/L Tris-HCl pH8.0）混勻后加入超濾離心管，14 000×g離心15 min。再加入200 μL UA buffer 14 000×g離心15 min，棄濾液。加入100 μL IAA（50 mmol/L IAA in UA），600 rpm振蕩1 min，避光室溫孵育30 min，14 000×g離心10 min。加入100 μL UA buffer，14 000×g離心10 min，重復2次。加入100 μL Dissolution buffer，14 000×g離心10 min，重復2次。加入40 μL Trypsin buffer（2 μg Trypsin in 40 μL Dissolution buffer），600×g振蕩1 min，37℃孵育16 h進行酶解。14 000 ×g離心10 min，取濾液，D280肽段定量[10]。各組樣品肽段分別取80 μg，按照AB SCIEX公司iTRAQ Reagent-8plex Multiplex試劑盒說明書進行標記。標記分組如下：實驗1-113、實驗2-114、實驗3-115、對照1-116、對照2-117、對照3-118。

1.8 SCX分級使用AKTA Purifier 100（GE Healthcare）和層析柱Polysulfoethyl 4.6×100 mm column（5 μm、200?）（PolyLCInc, Maryland,U.S.A）對樣品進行分級處理。將標記后的所有肽段混合，進行SCX預分級。SCX分級后，收集洗脫36份fraction，根據(jù)SCX色譜圖合并成15份，凍干后C18 Cartridge（Sigma）脫鹽。

1.9 質(zhì)譜分析每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進行分離。色譜柱用95%的A液（0.1%甲酸水溶液）平衡后，樣品加至上樣柱Thermo scientific EASY column（2 cm×100 μm 5μm-C18），再經(jīng)分析柱Thermo scientific EASY column（75 μm×100 mm 3 μm-C18）分離，流速為300 nL/min。相關(guān)液相梯度如下：0 min～50 min，B液（0.1%甲酸，84%乙腈水溶液）線性梯度從0%到40%；50 min～58 min，B液線性梯度從40%到100%；58 min～60 min，B液維持在100%。

經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后的樣品用Q-Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan）進行質(zhì)譜分析。分析時長：60 min；檢測方式：正離子；母離子掃描范圍：300-1800 m/z；一級質(zhì)譜分辨率：70 000 at m/z 200；AGC target：3e6，一級Maximum IT：10 ms；Number of scan ranges ：1，Dynamic exclusion：40.0 s。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比采集方法：每次全掃描后采集10個碎片圖譜（MS2 scan）；MS2 Activation Type：HCD；Isolation window：2 m/z；二級質(zhì)譜分辨率：17 500 at m/z 200；Microscans：1；二級Maximum IT：60 ms；Normalized collision energy：30 eV；Underfill ratio：0.1%。

1.10 數(shù)據(jù)分析用軟件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4（thermo）進行查庫鑒定及定量分析。使用數(shù)據(jù)庫：uniprot_gallus_gallus_36088_20170518.fasta（蛋白質(zhì)序列：36 088條；下載日期：20170518）。

1.11 生物信息學分析根據(jù)蛋白質(zhì)的豐度水平，實驗組與對照組差異倍數(shù)＞1.3 or ＜0.77，且p＜0.05[11-12]時，認定為差異蛋白，結(jié)合Gene ontologv（http://www.geneontologv.org/）、KEGG、STRING、uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行GO注釋及代謝通路分析。運用顯著性差異檢驗方法，用COG數(shù)據(jù)庫對差異蛋白質(zhì)富集的GO條目以及顯著性富集的Pathway進行比對，對這些蛋白質(zhì)功能進行分析。

1.12 qPCR驗證差異表達蛋白收集子孢子感染72 h和未感染的細胞樣品，用Trizol試劑按說明書提取細胞總RNA。使用DNaseI去除總RNA中基因組DNA，參照RNeasy? Mini Kit說明書對總RNA進行純化，用SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進行第一鏈cDNA的合成，用QIA quick? PCR試劑盒純化cDNA。本次試驗

以β-actin作為內(nèi)參，共檢測10個基因，引物信息見表1。按照TaKaRa熒光定量試劑盒說明書進行試驗操作，反應體系：cDNA（1 μL）、SYBRR Premix Dimer Eraser（2×）（10 μL）、ROX Reference DyeⅡ（1μL）、無RNase水（7.2 μL）和10 mmol/L正向和反向引物（各0.4 μL）。用Q5熒光定量PCR儀進行擴增，第一階段：預變性，1個循環(huán)，95℃30 s；第二階段：40個循環(huán)，95℃ 5 s，60℃ 30 s；第三階段：溶解曲線。每個樣本設置3個重復，按照公式：ΔΔCt=（Ct目的RNA-Ct內(nèi)參）處理組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參）對照組）對目的基因mRNA的Ct值作轉(zhuǎn)換，表示試驗組表達量于對照組的倍數(shù)改變。用SPASS 21.0對其進行比較，P值為0.05。

1.13 Western blot驗證差異表達蛋白子孢子感染72 h和未感染的細胞，預冷PBS洗滌3次，然后加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，最后收集細胞裂解液，4℃、12 000×g15 min，收集上清液即蛋白。BCA法檢測細胞總蛋白濃度，以β-actin為參照調(diào)整蛋白樣品上樣量。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂乳（PBS稀釋）4℃封閉12 h，PBST洗滌3次，加入兔FABP4抗體（1∶200稀釋，本實驗室制備），37℃孵育2 h，經(jīng)洗滌加入熒光二抗（1∶5000），孵育1 h后，PBST洗滌4次，再經(jīng)PBS洗滌1次后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)成像，Image J軟件對圖片進行分析。

表1 熒光定量PCR的特異性引物序列Table 1 Sequences of gene-specific primers for qPCR assays

2.結(jié)果

2.1 差異蛋白的鑒定通過對原始數(shù)據(jù)的分析和統(tǒng)計，共定量到23 614個唯一肽段和3 967個蛋白質(zhì)。將感染組和對照組進行比較，差異倍數(shù)≥1.3或≤0.7且P<0.05視為有差異[13]，共鑒定到259個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白145個，下調(diào)蛋白114個。下調(diào)最為明顯的5個差異蛋白包括脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）、Staufen雙鏈RNA結(jié)合蛋白2（STAU2）、DNA拓撲異構(gòu)酶（TOP3A）、組蛋白1（H1）、起始識別復合物亞基5（ORC5）；上調(diào)最為明顯的5個蛋白包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、DEAD box解旋酶20（DDX20）、Wnt家族復合物2B（WNT2B）和2個未知蛋白，詳見表2。這表明蟲體的入侵和發(fā)育會引起CEF細胞發(fā)生一系列蛋白質(zhì)組的變化從而應對蟲體的感染。

表2 前5個下調(diào)和上調(diào)差異表達蛋白Table 2 The top five down-regulate and up-regulate differentially expressed proteins

2.2 生物信息學分析GO分析結(jié)果顯示，在生物學過程（biological process）方面，差異蛋白主要富集在細胞內(nèi)過程（cellular process）15%、單一生物過程（single-organism process）13%、代謝過程（metabolic process）12%、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）10%等（圖1A），說明蟲體感染會使宿主細胞發(fā)生一系列的生物過程。在細胞內(nèi)組分（cellular component）方面，差異蛋白主要富集在細胞（cell）18%、細胞部分（cell part）17%、細胞器（organelle）16%、細胞器部分（organelle part）8%、膜（membrane）8%等（圖1B）。在分子功能（molecular function）方面，差異蛋白主要富集在結(jié)合（binding）52%、催化活性（catalytic activity）29%、轉(zhuǎn)運子活性（transporter activity）4%等（圖1C）。

KEGG通路分析表明，差異蛋白富集到的通路主要有細胞外基質(zhì)受體互作（E M C-receptor interaction）、糖酵解/糖異生（glycolysis/gluconeogensis）、粘著斑（focal adhesion）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism）等（圖2）。

2.3 qPCR驗證差異蛋白使用qPCR的方法檢測了10個差異基因的mRNA水平變化。結(jié)果顯示：ALDH1A2、MAP1B、MMP2、RPS27A、CNBP、MAEA、CD164、GAPDH等8個基因的mRNA水平變化與iTRAQ結(jié)果中蛋白水平變化相一致，而FABP4和TOP3A 2個基因的mRNA水平變化與iTRAQ結(jié)果中蛋白水平變化不一致。

2.4 Western blot驗證差異蛋白用Western blot方法對差異蛋白FABP4在蛋白水平進行了驗證。結(jié)果顯示：與未感染組相比，子孢子感染72 h組細胞FABP4的表達量顯著降低（圖3），與iTRAQ的結(jié)果保持一致。

3 討論

圖1 柔嫩艾美耳球蟲感染CEF細胞后259個差異表達蛋白的GO分析Fig.1 Gene ontology analysis of 259 proteins differentially expressed in CEF cells infected with Eimeria tenella

圖2 富集的前10個KEGG通路Fig.2 Top 10 enriched KEGG processes

越來越多的證據(jù)表明，宿主細胞提供了球蟲子孢子與宿主細胞識別和相互作用的前提條件[14]，所以研究子孢子感染后的宿主差異表達蛋白對探究艾美耳球蟲的感染機制有重大意義。本研究利用iTRAQ技術(shù)對柔嫩艾美耳球蟲子孢子感染72 h的CEF細胞和未感染的CEF細胞之間的差異蛋白進行了篩選。選取CEF細胞作為宿主細胞，CEF細胞為雞胚原代成纖維細胞，原代細胞比其它傳代細胞更加適于蟲體的入侵和發(fā)育，并且該細胞來源于雞更貼近體內(nèi)真實感染情況。我們共獲得了259個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白145個，下調(diào)蛋白114個。利用qPCR檢測了10個差異蛋白在球蟲感染后細胞的mRNA水平變化，以驗證iTRAQ結(jié)果的準確性，發(fā)現(xiàn)8個基因的結(jié)果與iTRAQ的一致，而FABP4和TOP3A的結(jié)果不一致。利用Western blot對FABP4在球蟲感染細胞中的蛋白水平變化，結(jié)果與iTRAQ的保持一致。驗證的結(jié)果表明大多數(shù)差異表達蛋白的調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平上直接進行的，但也有少量蛋白的表達水平與其基因轉(zhuǎn)錄水平不匹配，原因在于蛋白的豐度不僅取決于轉(zhuǎn)錄水平，還取決于翻譯后修飾[15]。為了分析差異蛋白在球蟲感染中的作用，將它們分為刺激和防御（stress and defense）、免疫反應（immune response）、代謝（metabolism）和凋亡（apoptosis）4個方面進行討論。

當受到寄生蟲感染時，宿主細胞的皮膚或粘膜屏障、天然免疫系統(tǒng)、抗寄生蟲特異性免疫機制等會發(fā)生相應的變化以抵抗蟲體的入侵。例如，腸上皮細胞會產(chǎn)生許多抗微生物多肽作為天然免疫的一部分以抵抗隱孢子蟲的感染[16]。惡性瘧原蟲可誘導人外周血單核細胞IFN-β mRNA和蛋白的高表達[17]。本研究篩選出了一些與宿主應激和防御相關(guān)的差異蛋白，其中干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）在子孢子感染后明顯上調(diào)（感染組/未感染組比值1.40），IRF3主要負責干擾素-β（IFN-β）的誘導，對干擾素反應的激活有著重要作用[18]，其在天然免疫和適應性免疫的作用是當前研究的熱點[19]。因此我們推測這些與刺激和防御相關(guān)的差異蛋白在宿主抵抗艾美耳球蟲感染方面發(fā)揮重要作用。

表3 差異表達蛋白的qRT-PCR驗證Table 3 Verification of differently expressed proteins by qRT-PCR

圖3 差異表達蛋白的Western blot驗證Fig.3 Verification of differently expressed proteins by Western blot

宿主感染寄生蟲后可通過不同的免疫機制調(diào)節(jié)機體免疫保護以清除蟲體。例如，隱孢子蟲感染宿主細胞時，宿主細胞會產(chǎn)生趨化因子來清除并殺死隱孢子蟲[20]。同時，寄生蟲也擁有強大而多變的免疫扭轉(zhuǎn)策略，能夠逃避宿主免疫攻擊，造成宿主持續(xù)性感染[21]。Mangan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，曼氏血吸蟲感染后可誘導IL-10 B細胞增加，保護小鼠抵抗實驗誘導的系統(tǒng)性過敏反應。本研究發(fā)現(xiàn)，子孢子感染后自噬相關(guān)蛋白5（ATG5）呈明顯下調(diào)表達（感染組/未感染組比值0.66），ATG5在自噬泡的形成過程中起重要作用[23]，并具有促凋亡活性[24]，這與本研究發(fā)現(xiàn)子孢子感染后Caspase-3呈下調(diào)表達結(jié)果一致。在原代巨噬細胞中，干擾素（IFN-γ）/LPS破壞剛地弓形蟲寄生液泡膜和寄生蟲清除時需要ATG5的參與[25]。我們推測，在球蟲子孢子感染宿主細胞后，蟲體會抑制宿主細胞ATG5產(chǎn)生，以防止被宿主清除。

頂復門原蟲需要從宿主細胞內(nèi)獲取營養(yǎng)物質(zhì)來維持自身的發(fā)育和增殖[26]。本試驗所鑒定出的與代謝相關(guān)的通路主要有脂質(zhì)代謝通路、氨基酸合成通路、核苷酸合成代謝等，其中brahma相關(guān)基因1（Brg1）在子孢子感染后表達量增高（感染組/未感染組比值1.30）。Brg1是依賴ATP的染色質(zhì)改變復合物的核心催化亞基[27]，可以募集其他亞基并組成相應的重塑復合物、識別目的基因序列進而發(fā)揮染色質(zhì)重塑[28]，從而達到調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄功能。據(jù)報道，Brg1可以通過參與調(diào)控RUNX2的表達，調(diào)控成骨分化過程的進行[29]，也參與了細胞衰老、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞分化等多種生物學過程。Brg1的上調(diào)可能是由于蟲體入侵后，引起宿主發(fā)生了一系列基因的表達的變化而引起的。

頂復門原蟲如隱孢子蟲[30]、泰勒蟲[31]、弓形蟲[32]、艾美球蟲[33]均能夠介導宿主細胞凋亡從而調(diào)控寄生蟲在宿主內(nèi)的發(fā)育。有研究表明，柔嫩艾美耳球蟲可誘導NF-kappa B激活，以保護宿主細胞不受凋亡的影響使其有良好的發(fā)育環(huán)境，在裂殖體成熟后，引起NF-kappa B抑制，觸發(fā)宿主細胞凋亡，從而促進裂殖子的逸出[32]。我們發(fā)現(xiàn)在子孢子感染后，Caspase-3的下調(diào)表達（感染組/未感染組比值0.66），可能是蟲體通過抑制其表達，從而抑制宿主細胞的凋亡，以促進其在宿主細胞內(nèi)的存活和發(fā)育。

本研究采用了iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)來分析E. tenella感染和未感染的CEF細胞之間的差異蛋白質(zhì)表達變化，共鑒定到259個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白145個，下調(diào)蛋白114個，這些差異表達蛋白主要參與了細胞外基質(zhì)受體互作、糖酵解/糖異生、粘著斑、氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等生物學功能，具有結(jié)合活性、催化活性、轉(zhuǎn)運子活性等分子功能。本實驗的研究結(jié)果為探索寄生蟲與宿主相互作用的機制提供了一個新的視角。