張曉羽，蘭亞如，張曉娣，楊浩凱，李飛龍，薛曉楠，吳 成，王 琦，蘇春霞

(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

枸杞是一種傳統(tǒng)中草藥，枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)是其主要生物活性成分[1]，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖組成，具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)功能，包括抗氧化、抗炎、抗癌和抗輻射活性等[2-5]。已經(jīng)報道了LBP的許多有益健康的影響，例如免疫調(diào)節(jié)、抗應(yīng)激、抗結(jié)腸癌、神經(jīng)保護和抗糖尿病作用[5-8]。一些研究還發(fā)現(xiàn)LBP具有心肌保護、眼睛保護、抗輻射損傷和抗衰老作用。在免疫學(xué)方面LBP主要調(diào)節(jié)T細胞、CTL細胞、NK細胞、腹腔巨噬細胞及樹突狀細胞(dendritic cells,DC)的功能。有研究表明，LBP(100 g·L-1)可增加骨髓來源樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)中Ⅰ-A/Ⅰ-E和CD11c的共表達以及IL-12 p40的分泌，這表明LBP能夠在體外促進小鼠BMDCs的表型和功能成熟[9]。LBP還可以上調(diào)CD40、CD80、CD86和MHC Ⅱ類分子，下調(diào)DC對抗原的攝取，增強DC的共刺激活性，并誘導(dǎo)IL-12p40和p70產(chǎn)生[2]。然而，LBP發(fā)揮作用的分子機制尚未闡明。

目前，一般認為Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)4/2是多糖的主要受體。 一位日本學(xué)者首先報道，紅花多糖通過Toll樣受體4激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB并誘導(dǎo)細胞因子的產(chǎn)生[10]。大量研究表明，幾種多糖可顯著激活巨噬細胞中TLR4-MAPK信號通路并誘導(dǎo)TNF-α，IL-1β和IFN-α/β的產(chǎn)生[11]。在本研究中，我們探討了LBP能否通過TLR2-NF-κB調(diào)控BMDC。

1 材料與方法

1.1 實驗材料SPF級，6～8周C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(動物合格證號：SCXK(京)2016-0006)。枸杞多糖(純度>90%)購自陜西楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司；脂多糖(純度≥99%)購自Biotopped公司。GM-CSF和IL-4均購自Peprotech公司；C29購自Ab Mole公司，紅細胞裂解液購自Solarbio公司，BI 1640培養(yǎng)基、BI胎牛血清(fetal bottles bovine，F(xiàn)BS)購自BI公司，青霉素-鏈霉素購自Solarbio公司，凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液均購自kaiji公司；β-actin、TLR2、NF-κB、p38探針購自美國Thermo Fisher公司；TLR2兔單克隆抗體、NF-κB兔單克隆抗體、p-NF-κB兔單克隆抗體、p38兔單克隆抗體、p-p38兔單克隆抗體均購自美國CST公司；RNA提取試劑盒(離心柱式)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；購自Z383型水平離心機，德國Hermle Labortechnik GmbH公司；多功能酶標(biāo)儀(Thermo，美國)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Amersham Imager 600)。

1.2 細胞培養(yǎng)及給藥取6～8周C57BL/6小鼠，無菌取出股骨和脛骨，分離骨髓細胞，用含RPMI 1640、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，棄去非貼壁細胞，用含20 μg·L-1GM-CSF、20 μg·L-1IL-4的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，37° 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天半量換液。d 7，收集懸浮及半貼壁細胞分別用低濃度(50 mg·L-1)、中濃度(100 mg·L-1)、高濃度(200 mg·L-1)枸杞多糖，脂多糖(100 μg·L-1)(作為陽性對照)、RPMI 1640(作為陰性對照)。

1.3RT-qPCR按上述方法收獲用不同處理組的細胞后，嚴格按照RNA提取試劑盒提出RNA，測濃度，加入20 μL體系進行逆轉(zhuǎn)錄，最后用RT-qPCR試劑進行PCR。

1.4Westernblot按上述方法收獲用不同處理組的細胞后，嚴格按照全蛋白提取試劑盒操作。BCA法測蛋白濃度。8% SDS-PAGE凝膠電泳，5%脫脂奶粉封閉90 min；放入一抗工作液，4 ℃孵育過夜；PBST洗膜，10 min×3次；放入相應(yīng)二抗工作液中，室溫90 min；PBST洗膜，10 min×3次；ECL顯影，用ImageJ軟件對條帶進行灰度值檢測，結(jié)果用計算公式：目的蛋白的相對表達量=目的蛋白光密度值/β-actin光密度值。

2 結(jié)果

2.1 LBP對BMDC中TLR2、NF-κB、p38 mRNA的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，RPMI 1640組、50 mg·L-1LBP組、100 mg·L-1LBP組和200 mg·L-1LBP組和100 μg·L-1LPS組TLR2 mRNA的相對表達量分別為(6.55±0.20)、(8.83±1.29)、(9.29±2.71)、(11.66±3.67)和(9.71±3.05)(Fig 1A)。與RPMI 1640組比較，200 mg·L-1LBP組(P<0.05)中TLR2的mRNA表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 1A)。

Fig 1 Effect of LBP on TLR2, NF-κB,and p38 mRNA expression in *P<0.05,**P<0.01 vs control

RPMI 1640組、50 mg·L-1LBP、100 mg·L-1LBP組、200 mg·L-1LBP組和100 μg·L-1LPS組NF-κB mRNA的相對表達量分別為(3.27±0.18)、(10.83±0.77)、(20.42±3.07)、(41.61±14.12)和(25.32±5.97)(Fig 1B)。與RPMI 1640組比較，各組NF-κB的mRNA表達水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

RPMI 1640組、50 mg·L-1LBP、100 mg·L-1LBP組、200 mg·L-1LBP組和100 μg·L-1LPS組p38 mRNA的相對表達量分別為(7.06±2.93)、(8.27±1.88)、(10.65±2.94)、(12.27±1.02)(11.01±4.28)(Fig 1C)。與RPMI 1640組比較，200 mg·L-1LBP組(P<0.05)中p38的mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 LBP對BMDC中TLR2、p-NF-κB、NF-κB 、p-p38及p38蛋白表達水平的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，RPMI 1640組、50 mg·L-1LBP、100 mg·L-1LBP組、200 mg·L-1LBP組和100 μg·L-1LPS組TLR2蛋白相對表達量分別為(0.64±0.12)、(0.95±0.12)、(1.08±0.09)、(1.14±0.12)、(1.00±0.26)(Fig 2B)。與RPMI 1640組比較，各組中TLR2蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 2B)。

Fig 2 Effect of LBP on TLR2, NF-κB, p-NF-κB,p38, p-p38 protein expression in *P<0.05,**P<0.01 vs control

RPMI 1640組、50 mg·L-1LBP、100 mg·L-1LBP組、200 mg·L-1LBP組和100 μg·L-1LPS組p-NF-κB/NF-κB 蛋白相對表達量分別為(0.68±0.03)、(0.71±0.07)、(0.71±0.01)、(0.85±0.04)、(1.17±0.14)(Fig 2B)。與RPMI 1640組比較，200 mg·L-1LBP組(P<0.01)、100 μg·L-1LPS組(P<0.05)中p-NF-κB/NF-κB蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 2B)。

RPMI 1640組、50 mg·L-1LBP、100 mg·L-1LBP組、200 mg·L-1LBP組和100 μg·L-1LPS組p-p38/p38蛋白相對表達量分別為(0.79±0.01)、(0.84±0.01)、(0.91±0.01)、(1.04±0.04)、(1.09±0.002)(Fig 2B)。與RPMI 1640組比較，各組p-p38/p38蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 2B)。

2.3 C29(TLR2阻斷劑)對 LBP誘導(dǎo)的BMDC中TLR2、NF-κB、p38 mRNA表達水平的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，RPMI 1640+C29組、RPMI 1640組，100 μg·L-1LPS+C29組、100 μg·L-1LPS組和200 mg·L-1LBP+C29組、200 mg·L-1LBP TLR2 mRNA的相對表達量分別為(9.83±1.58)、(10.74±1.82)、(9.79±1.05)、(15.02±1.78)、(9.47±0.72)和(14.5±1.45)(Fig 3A)；NF-κB mRNA的相對表達量分別為(11.67±3.05)、(13.01±1.05)、(28.67±2.08)、(62.67±8.78)、(25.02±7.21)、(48.35±6.14)(Fig 3B)。p38 mRNA的相對表達量分別為(11.93±0.14)、(11.02±2.48)、(11.01±0.23)、(18.70±2.25)、(13.38±0.13)、(17.19±3.18)(Fig 3C)。與200 mg·L-1LBP組比較，200 mg·L-1LBP+C29組TLR2(P<0.01)，NF-κB(P<0.01)的mRNA表達水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 3A,B)，p38(P=0.565)的mRNA表達量有減少的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 3C)。

Fig 3 Effect of C29 on TLR2, NF-κB, p38 mRNA expression in BMDCs induced by **P<0.01 vs LPS+C29;##P<0.01 vs LBP+C29

2.4 C29(TLR2阻斷劑)對 LBP誘導(dǎo)的BMDC中TLR2、NF-κB、p38蛋白表達水平的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，RPMI 1640+C29組、RPMI 1640組，100 μg·L-1LPS+C29組、100 μg·L-1LPS組和200 mg·L-1LBP+C29組、200 mg·L-1LBP TLR2 蛋白相對表達量分別為(0.60±0.01)、(0.69±0.02)、(0.96±0.03)、(1.41±0.05)(1.03±0.06)、(1.66±0.07)；pNF-κB蛋白相對表達量分別為(0.72±0.01)、(0.76±0.02)、(0.88±0.01)、(0.95±0.02)、(0.94±0.03)、(0.99±0.01)；p-p38蛋白相對表達量分別為(0.46±0.01)、(0.45±0.01)、(0.84±0.02)、(0.86±0.02)、(1.11±0.01)、(1.16±0.02)。見Fig 4。與200 mg·L-1LBP組比較，200 mg·L-1LBP+C29組TLR2(P<0.01)，p-NF-κB(P<0.05)，p-p38(P<0.01)的蛋白表達水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見Fig 4B。

Fig 4 Effect of C29 on TLR2, NF-κB, p-NF-κB, p38, p-p38 protein expression in BMDCs induced by △P<0.05 vs 1640+C29;**P<0.01 vs LPS+C29;#P<0.05,##P<0.01 vs LBP+C29

3 討論

近年來，人們對枸杞多糖的研究不斷深入，作為免疫調(diào)節(jié)劑不僅可以增強機體免疫、降血脂、抗衰老、抗腫瘤作用，并且來源廣泛，毒副作用小[12]。LBP作為新型的免疫調(diào)節(jié)劑其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要靶細胞為巨噬細胞、淋巴細胞、NK細胞、DC。有研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖蛋白復(fù)合物(polysaccharide-protein complex from L. barbarum，LBP3p) 顯著增強巨噬細胞的吞噬作用并抑制可移植肉瘤S180的生長[13]。此外，從枸杞果實中分離得到的LBP可以抑制HeLa細胞的增殖[14]，刺激小鼠腹膜巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α和IL-1β，并以TLR4依賴性方式促進淋巴細胞的增殖[11]。

DC最作為有效的抗原呈遞細胞之一，是固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，是免疫應(yīng)答的發(fā)起者和調(diào)節(jié)者。最近研究顯示,LBP在體內(nèi)外均可上調(diào)DC表面分子MHCII、CD40、CD80、CD86的表達，并促進DC分泌IFN-γ、 TNF-α 、IL-4 和 IL-6，誘導(dǎo)DC表型和功能的成熟，但其是否通過TLR2調(diào)控BMDC的分子機制尚未闡明。

TLRs是一類在宿主免疫系統(tǒng)中具有重要作用的模式識別受體，其通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化NF-κB/ MAPK誘導(dǎo)各種細胞因子的釋放參與機體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及組織修復(fù)等過程。其中TLR2是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的TLRs-NF-κB/ MAPK信號通路上的重要成員[15]。本研究在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)200 mg·L-1LBP可以明顯上調(diào)BMDC中TLR2、p38 mRNA表達水平，50、100、200 mg·L-1LBP以濃度依賴的方式誘導(dǎo)BMDC中NF-κB mRNA的表達；Western blot結(jié)果顯示，在翻譯水平LBP可以促進TLR2、p-NF-κB、p-p38蛋白的表達，提示LBP可以誘導(dǎo)TLR2、NF-κB、p38基因翻譯為有功能的蛋白而發(fā)揮作用。為了進一步研究LBP是否通過TLR2-NF-κB/MAPK p38通路調(diào)控DC，TLR2抑制劑C29阻斷DC中TLR2后，分別從mRNA和蛋白水平檢測下游分子NF-κB、 p38的表達。阻斷實驗發(fā)現(xiàn)，阻斷TLR2后DC中NF-κB 和p38磷酸化蛋白的表達均明顯減少，提示LBP通過TLR2-NF-κB/MAPK p38通路調(diào)控DC。另外，C29對DC中p38 mRNA表達的影響還有待進一步探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LBP可能通過誘導(dǎo)BMDC表面TLR2的表達促進下游NF-κB/p38的活化，從而促進BMDC的成熟，為進一步研究LBP作為免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)控BMDC的分子機制提供理論依據(jù)。