張秀麗,雷 昌,劉 洋,葛金文,張君宇，任永鎮(zhèn)，資 冬，王 婧，朱 偉

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心； 2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)心腦疾病中西醫(yī)結(jié)合防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208)

缺血性卒中(ischemic stroke)約占全部腦卒中的80%～87%，其危害性廣、致殘率高[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)由于其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和保護(hù)的雙重作用，在缺血性卒中的防治中日益受到重視。正常情況下，MG呈靜息態(tài)，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，其迅速極化。極化的MG有兩種類型：M1型的MG可引發(fā)神經(jīng)損傷、凋亡，產(chǎn)生并加重腦損傷，而M2型的MG可通過促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、血管生成、軸突重塑及髓鞘再生等參與腦修復(fù)，MG極化釋放的炎癥因子貫穿于缺血/再灌注損傷病理發(fā)展的全過程[2-4]。因此，調(diào)控MG極化已成為治療缺血性腦卒中的新靶點(diǎn)和新策略。

缺血性腦卒中(腦梗塞)屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，“氣虛血瘀”系其中醫(yī)病機(jī)關(guān)鍵，因此，治宜以“益氣活血”為法。課題組前期采用具有“益氣活血”作用的腦泰方治療氣虛血瘀證腦梗塞取得較好療效[5]，前期研究表明其可降低梗死患神經(jīng)元損傷[6]、促進(jìn)神經(jīng)再生[7]，后在腦泰方基礎(chǔ)上加味形成的腦泰方Ⅱ號(hào)可明顯抑制體外培養(yǎng)的MG的M1型極化，促進(jìn)M2型極化(在發(fā)表)。本文重點(diǎn)對局灶性腦缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠造模后1周內(nèi)皮質(zhì)MG極化形態(tài)與極化標(biāo)志進(jìn)行研究，并采用腦泰方Ⅱ號(hào)進(jìn)行干預(yù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立84只♂SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(300±50) g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常組(6只)、假手術(shù)組(6只)、MCAO模型組(24只)、米諾環(huán)素組(24只)、腦泰方Ⅱ號(hào)組(24只)。采用大腦中動(dòng)脈線栓法復(fù)制MCAO大鼠模型，動(dòng)物于清醒后2 h參照Longa的5分制法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，分值在1～3分者入組，動(dòng)物清醒后爬行時(shí)向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)，嚴(yán)重時(shí)向右跌倒，提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲提示造模成功。實(shí)驗(yàn)所用SD大鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：SYXK(湘)2009-0001。

1.2 藥物制備與給藥腦泰方Ⅱ號(hào)由黃芪、川芎、防風(fēng)、地龍、白術(shù)、僵蠶組成，藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，購置藥材選擇黃芪甲苷、川芎嗪、阿魏酸成分含量為考察指標(biāo)進(jìn)行藥材質(zhì)量控制，經(jīng)檢測每80 g復(fù)方中含有川芎嗪0.36 mg、阿魏酸2.52 mg、黃芪甲苷13.72 mg，合格的藥材經(jīng)水煎醇提濃縮后制成。藥物結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)，腦泰方Ⅱ號(hào)按9.18 g·kg-1灌胃給藥；鹽酸米諾環(huán)素(M9511) , 購自Sigma公司，溶解后按50 mg·kg-1腹腔注射給藥；腦泰方Ⅱ號(hào)和鹽酸米諾環(huán)素均從造模成功后d 1即開始，連續(xù)給藥1周。

1.3 激光共聚焦觀察MCAO模型組于造模成功后于d 1、3、5、7處死大鼠，米諾環(huán)素組與腦泰方Ⅱ號(hào)組于給藥d 1、3、5、7處死大鼠，留取距額葉前端1/3～2/3處腦組織，固定后石蠟切片，免疫熒光染色(Iba1一抗，abcam ab5076； FITC二抗，abcam ab6881)，激光共聚焦(Zeiss LSM800)觀察皮質(zhì)MG形態(tài)。

1.4 Real-time PCR法檢測相關(guān)基因的表達(dá)取與“1.3”相應(yīng)部位的腦組織皮質(zhì)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，real time-PCR(Bio-Rad 7900HT)檢測M1型標(biāo)志分子MHCⅡ、iNOS、MCP-1、CD11b，M2型標(biāo)志分子Arg1(精氨酸酶)、Mrc1(甘露糖受體)、Ym1(幾丁質(zhì)酶)的表達(dá)。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche，貨號(hào)：04 896 866 001)；NoVoStart SYBR qPCR SuperMix plus(NoVoprotein，貨號(hào)：E096-01A)。引物序列見Tab 1。

1.5 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0 計(jì)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組總體比較方差齊者用方差分析，兩兩比較用Q檢驗(yàn)，方差不齊者用Tamhane檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MCAO大鼠腦皮質(zhì)MG極化形態(tài)的變化及腦泰方Ⅱ號(hào)的作用正常組與假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)區(qū)MG呈靜息態(tài)，表現(xiàn)為胞體較小，分支較細(xì)(如Fig 1 A、B、F、G)；與空白組比較，MCAO模型組MG胞體明顯增大、變形，突觸變短、變粗，分支減少(如Fig 1 C1、C2、C3、C4、H、I)，但從d 5開始部分MG突觸分支增加，如Fig 1C3、C4、J、K)。

經(jīng)腦泰方Ⅱ號(hào)干預(yù)后d 3 MG突觸分支增加(如Fig 1D2)，從d 5～7，分支增加的MG數(shù)量增多(如Fig 1 D3、D4)，部分胞體體積呈現(xiàn)回縮(如Fig 1 M)。米諾環(huán)素組亦可逆轉(zhuǎn)MG胞體脹大、突觸分支減少的狀況，且在d 3效果就比較明顯(如Fig 1 E2)，但在d 5～7米諾環(huán)素促M(fèi)G分支的作用有下降的趨勢(如Fig 1 E3、E4、N)。

Fig 1 Morphological changes of MG at different time points in each group (200×)A. Normal group; B. Sham-operated group; C1～C4. MCAO model group; D1～D4. minocycline group; E1～E4. Naotaifang Ⅱ group.F，G：microglia in "resting"；H, I：M1 polarized microglia with expanded cell body，short and thick synapses；J, K, M, N：Polarized microglia from M1 to M2 with increased synaptic branches, lengthen, thin.

2.2 M1型標(biāo)志分子MHCⅡ、iNOS、MCP-1、CD11b的表達(dá)變化及腦泰方Ⅱ號(hào)對M1型極化的抑制作用與假手術(shù)相比，模型組M1型標(biāo)志分子MHCⅡ、iNOS、MCP-1、CD11b表達(dá)都明顯增加(P<0.01，F(xiàn)ig 2)，其中尤以MCP-1的變化最為劇烈(Fig 2C)。從時(shí)間表達(dá)軸上看，模型組MHCⅡ的表達(dá)在d 3最高，之后逐漸減少(Fig 2A)；iNOS、MCP-1與CD11b的表達(dá)在d 5達(dá)到最高，之后出現(xiàn)不同程度的下降(Fig 2B、C、D)。

Fig 2 MRNA expression of M1 markers MHCⅡ, iNOS, MCP-1 and CD11b in MCAO model rats n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs sham

與模型組相比，腦泰方Ⅱ號(hào)在d 3后可明顯降低MHCⅡ、iNOS的表達(dá)(P<0.05或P<0.01，見Fig 3A、B)，但在d 5后才對MCP-1與CD11b的表達(dá)有明顯調(diào)節(jié)作用(P<0.01，見Fig 3C、D)；米諾環(huán)素對iNOS、CD11b的調(diào)節(jié)作用從d 1差異有顯著性(P<0.05，見Fig 3B、D)，對MHCⅡ、MCP-1調(diào)節(jié)作用從d 3差異有顯著性(P<0.01，見Fig 3A、C)。

與米諾環(huán)素相比，腦泰方Ⅱ號(hào)對MHCⅡ的抑制作用在d 3明顯弱于米諾環(huán)素(P<0.05)，在d 5后雖強(qiáng)于米諾環(huán)素，但差異無顯著性(P>0.05，見Fig 3A)；其對iNOS、MCP-1、CD11b的抑制作用均在d 5后才優(yōu)于米諾環(huán)素(P<0.05或P<0.01，見Fig 3B、C、D)。

Fig 3 Effects of NaotaifangⅡon mRNA expression of M1 markers MHCⅡ, iNOS, MCP-1 and CD11b n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs sham；#P<0.05，##P<0.01 vs model

2.3 M2型標(biāo)志分子Arg1、Mrc1、Ym1表達(dá)變化及腦泰方Ⅱ號(hào)的調(diào)節(jié)作用與假手術(shù)相比，模型組M2型標(biāo)志分子Arg1、Mrc1、Ym1表達(dá)在d 3、5均有明顯增加(P<0.05或P<0.01，見Fig 4)，但總體表達(dá)水平較M1型標(biāo)記分子偏低。從時(shí)間表達(dá)軸上看，模型組Arg1、Ym1的表達(dá)在d 3最高，之后逐漸減少(Fig 4A、C)；而Mrc1的表達(dá)在d 5達(dá)到最高，之后出現(xiàn)不同程度的下降(Fig 4B)。

Fig 4 MRNA expression of M2 markers Arg1, Mrc1, Ym1 in MCAO model rats n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs sham

與模型組相比，腦泰方Ⅱ號(hào)在d 3后可明顯升高Arg1、Mrc1、Ym1的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，且在d 5達(dá)到最高點(diǎn)(Fig 5)。米諾環(huán)素對Arg1、Mrc1、Ym1的調(diào)節(jié)作用從d 1起即差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)，但在3 d后其調(diào)節(jié)作用即下降。

與米諾環(huán)素組相比，腦泰方Ⅱ號(hào)雖在d 3對Arg1、Mrc1、Ym1的調(diào)節(jié)作用明顯弱于米諾環(huán)素組(P<0.01)，但在d 5～7均強(qiáng)于米諾環(huán)素組(P<0.01)。

Fig 5 Effects of NaotaifangⅡon mRNA expression of M2 markers Arg1, Mrc1 and Ym1 n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs sham；#P<0.05，##P<0.01 vs model

3 討論

MG的形態(tài)與MG的功能密切相關(guān)[8]，在非病理?xiàng)l件下，MG處于高度分支的靜息狀態(tài)，當(dāng)受到外界刺激后，MG迅速活化，并伴隨著突觸分支形態(tài)、數(shù)量，胞體體積等的變化[9]。本項(xiàng)研究結(jié)果表明，MCAO模型組皮質(zhì)MG胞體明顯增大、變形，突觸變短、變粗，分支減少，這與Chen 等[10-11]的研究結(jié)果一致。但本研究還發(fā)現(xiàn)，在d 5后MCAO大鼠皮質(zhì)MG有突觸分支增加、胞體回縮的趨勢，這可能與大鼠一定程度的自愈有關(guān)。與米諾環(huán)素相比，腦泰方Ⅱ號(hào)對MG極化調(diào)節(jié)有滯后性，米諾環(huán)素促M(fèi)G突觸分支與數(shù)量增加的作用在d 3效果就比較明顯，但腦泰方Ⅱ號(hào)促M(fèi)G突觸分支及數(shù)量增加的作用在d 5后效果才明顯。

MG表面標(biāo)記分子是區(qū)分M1型與M2型MG的重要標(biāo)志，其表達(dá)變化反映了M1/M2型MG在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過程。本項(xiàng)研究表明：MCAO大鼠皮質(zhì)MG在造模1 d后被激活，M1/M2型標(biāo)記分子的表達(dá)均增加，且不同M1/M2型標(biāo)記分子的表達(dá)具有時(shí)間差異，分別在d 3或d 5達(dá)到最高點(diǎn)，呈現(xiàn)出逐步被激活的趨勢。這與Hu等[12]的研究結(jié)果一致。但在本文中CD11b的表達(dá)在造模d 5達(dá)到高點(diǎn)后呈現(xiàn)出下降的趨勢，這與Hu等[12]的研究結(jié)果“CD11b持續(xù)上升”不一致，估計(jì)可能與造模損傷的程度有關(guān)[13]。除此之外本項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，M1型標(biāo)記分子在造模后均明顯增加，且分別在d 3或d 5達(dá)到最高點(diǎn)；而M2型標(biāo)記分子在造模后d 1雖有增加，但差異并無顯著性，造模后d 3、5雖明顯增加，但在d 7后回落，M2型標(biāo)記分子的表達(dá)變化(2～6倍)整體較M1型標(biāo)記分子變化較小，這一結(jié)果從側(cè)面解釋了MCAO模型后1周內(nèi)腦損傷的原因，且與本研究中形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。

腦泰方是課題組前期臨床研究獲得的具有“益氣活血”作用的、用于治療氣虛血瘀證腦梗塞的中藥復(fù)方，臨床藥效明顯[5]，后期在腦泰方的基礎(chǔ)上加入白術(shù)、防風(fēng)形成腦泰方Ⅱ號(hào)。方中以黃芪作為君藥，借其力專、性走，周行全身，大補(bǔ)脾胃元?dú)猓顨馔鷦t血活，血活則瘀除，以治其本；川芎活血行氣，白術(shù)健脾益氣，助君藥加強(qiáng)補(bǔ)氣之功，共為臣藥；防風(fēng)祛風(fēng)通絡(luò)，地龍、僵蠶通經(jīng)活絡(luò)，共為佐藥，諸味配合，共呈益氣活血通絡(luò)之效。本研究表明，腦泰方Ⅱ號(hào)可通過明顯降低M1型標(biāo)記分子MHCⅡ、iNOS、MCP-1、CD11b的表達(dá)抑制MG的M1型極化，通過促進(jìn)M2型標(biāo)志分子Arg1、Mrc1、Ym1表達(dá)促進(jìn)MG的M2型極化。但與米諾環(huán)素相比，腦泰方Ⅱ號(hào)對MG M1/M2型極化標(biāo)記分子的調(diào)節(jié)顯示出一定的滯后性，米諾環(huán)素在d 1到d 3逐步明顯激活M1型標(biāo)記分子，而腦泰方Ⅱ號(hào)在d 3～5逐步明顯激活M1型標(biāo)記分子；米諾環(huán)素在d 1即對M2型標(biāo)記分子起明顯調(diào)節(jié)作用，但腦泰方Ⅱ號(hào)對M2型標(biāo)記分子的調(diào)節(jié)作用在d 3才有顯著性；這也與本研究中形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果相一致。但腦泰方Ⅱ號(hào)又有自身獨(dú)特的優(yōu)勢，其在d 5后對M1/M2型MG極化標(biāo)記分子的調(diào)節(jié)作用均明顯優(yōu)于米諾環(huán)素組，這進(jìn)一步解釋了其在d 5～7，促M(fèi)G分支增加和數(shù)量增多的作用逐步增強(qiáng)的現(xiàn)象。

綜上，MCAO大鼠皮質(zhì)MG極化具有時(shí)序性，是一個(gè)逐步活化的過程；腦泰方Ⅱ號(hào)對缺血性卒中后皮質(zhì)MG極化具有明顯的調(diào)節(jié)作用。本項(xiàng)研究結(jié)果將為缺血性卒中的中醫(yī)藥治療提供新的理論依據(jù)與治療靶點(diǎn)，后續(xù)將進(jìn)一步對腦泰方Ⅱ號(hào)調(diào)節(jié)MG極化的分子機(jī)制進(jìn)行研究。