劉猛，史婷

（1.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033000；2.山西省特色植物功能成分工程研究中心，山西呂梁033000）

核桃富含礦物質(zhì)元素、維生素、膳食纖維以及各種營養(yǎng)成分和功能性成分[1]。其油脂中含有大量不飽和脂肪酸[2]，尤其含有很多對身體有益的油酸和亞油酸，也可能含有抗食道癌及中和鉛中毒的物質(zhì)[3-4]。核桃蛋白濃縮物和分離物可作為潛在的功能性食品成分[5]。近年來，我國核桃產(chǎn)量增加，2011年我國核桃年產(chǎn)量約為342萬噸，2017年我國核桃年產(chǎn)量約365萬噸[6-7]。以前核桃餅粕利用率很低，現(xiàn)在核桃副產(chǎn)物逐漸被開發(fā)成產(chǎn)品。比如核桃殼制備的活性炭、核桃粕制備的蛋白粉[8]。核桃粕生化性質(zhì)和物理性質(zhì)也被廣泛研究。經(jīng)研究，核桃餅粕的干物質(zhì)、粗脂肪、粗纖維和非植酸磷常規(guī)營養(yǎng)成分含量較高，粗蛋白含量與大豆餅粕等同類飼料相當(dāng)。維生素B1、維生素B6、錳及精氨酸等微量營養(yǎng)成分含量比大豆餅粕高[9]。

有研究證實(shí)了核桃蛋白經(jīng)過酶水解以后，其溶解性、乳化性、起泡性等功能特性有了很大的變化，經(jīng)酶修飾的蛋白可應(yīng)用于生產(chǎn)[10]。Paz-Yépez等研究了顆粒大小和腸道條件對核桃和花生體外脂質(zhì)和蛋白質(zhì)消化的影響。結(jié)果表明，堅(jiān)果顆粒大小對蛋白質(zhì)水解和分析基質(zhì)降解指數(shù)的影響最大。有研究也探究了不同水解度對大豆和花生分離蛋白的影響[11-12]，表明隨著水解度的增大，大豆蛋白持水性和最終黏度值降低，溶解性顯著性增大；花生蛋白熱穩(wěn)定性、溶解度和成膠能力提高，蛋白品質(zhì)得到提升[13-14]。不同油脂提取方法對核桃粉蛋白特性有影響，核桃分離蛋白功能特性因受到壓力而發(fā)生改變[15]。核桃仁蛋白酶解物可應(yīng)用于釀造，提高發(fā)酵性能。大豆天然蛋白的持水性很低，需要改性以提高持水性，使之應(yīng)用于食品加工中，來改善肉制品產(chǎn)品質(zhì)量[16]。這些研究說明了探究水解度對于核桃分離蛋白酶解物持水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性的影響有一定的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010S型）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；色拉油：市售；堿性蛋白酶（酶活1×105U/g）：河南安銳生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S型）：北京海天友誠儀器廠；離心機(jī)（SC-04型）：鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；酶標(biāo)儀（EPOCH2型）：美國伯騰儀器有限公司；電子天平（FA2104S）：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃分離蛋白的制備

用電子天平稱取200 g核桃餅粕，按照料液比1∶10（g/mL）的比例，加蒸餾水2 000 mL，混勻后利用酸沉堿提[17-18]的原理用1 mol/L氫氧化鈉滴定pH值至9.0，在超聲回流裝置中，50℃下提取1 h，之后放置30 min，置于離心機(jī)中3 000 r/min下離心20 min，結(jié)束后取出上清液，用1 mol/L鹽酸緩慢調(diào)其pH值至4.5，再次放入離心機(jī)3 000 r/min離心20 min，取出沉淀層，加蒸餾水調(diào)節(jié)pH值至中性，放入離心機(jī)3 000 r/min離心20 min，離心管里的下層即為分離蛋白溶液。最后用BCA蛋白濃度測定試劑盒于酶標(biāo)儀中測定后，處理數(shù)據(jù)得到核桃分離蛋白的濃度。

1.3.2 不同水解度核桃分離蛋白的制備

選擇堿性蛋白酶對分離蛋白進(jìn)行酶解，堿性蛋白酶酶解核桃餅粕分離蛋白的最優(yōu)酶解條件：底物濃度為 5.0%[分離蛋白 ∶水=1 ∶20（g/mL）]，酶解 pH 9，酶加入量 5 000 U/g，溫度 55 ℃[19]。分別酶解 20、40、60、80、100、120、140、160 min。同時做一組空白對照試驗(yàn)，在酶解過程中，滴入0.5 mol/L NaOH溶液，反應(yīng)液的pH值為恒定值9.0時停止滴入NaOH溶液。之后，將酶解液放入100°C水中滅酶15 min，冷卻后，調(diào)節(jié)pH值至7.0，4 000 r/min離心5 min，上清液為酶解后產(chǎn)物。

1.3.3 水解度的測定

水解度采用pH-stat法[20-21]進(jìn)行測定，根據(jù)水解過程中的0.5 mol/L NaOH（標(biāo)定）的消耗量來計(jì)算水解程度。每20 min記錄一次NaOH的消耗體積，直到完成所需水解過程，然后對此水解溶液進(jìn)行高溫滅酶處理，記錄滴定過程使用的NaOH溶液的總量。

水解度（degree of hydrolysis，DH）的計(jì)算如公式（1）所示：

式中：B為水解過程完成時NaOH溶液消耗量，mL；Nb為標(biāo)定的 NaOH 溶液實(shí)際濃度，mol/L；Mp為需要水解的核桃蛋白質(zhì)量，g；htot為核桃蛋白中肽鍵的總數(shù)，取8.0 mmol/g；α為蛋白氨基的平均解離度，通常取數(shù)值7。

1.3.4 持水性的測定

取28.7 mL酶解產(chǎn)物，放入10 mL水中，勻速攪拌直至混合，放在恒溫磁力攪動器中，調(diào)至溫度50°C保溫30 min。把上述溶液緩慢移入到確定質(zhì)量的離心管中，4 500 r/min離心20 min，把上面一層液體移除之后，稱出離心管與沉淀質(zhì)量。

持水性（water holding capacity，WHC）的計(jì)算如公式（2）所示：

式中：M為樣品質(zhì)量，g；M1為離心管和沉淀物的總質(zhì)量，g；M2為離心管和樣品的總質(zhì)量，g。

1.3.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

取28.7 mL酶解液，緩慢倒入40 mL水，再取40mL色拉油放入其中，在4 500 r/min下均質(zhì)2 min，完成后，再將液體倒入離心管1 500 r/min離心15 min。測出離心管中乳化層高度和液體的高度，兩者之比即為乳化性。

把以上液體放入90℃恒定溫度水中靜置30 min，然后降溫冷卻，15 000 r/min離心15 min，再次量出乳化層的高度。水浴后離心管中乳化層高度與初始乳化層高度之比即為乳化穩(wěn)定性。

1.3.6 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定

取28.7mL酶解液，加入100mL蒸餾水，4000r/min均質(zhì)2 min，測量泡沫總體積，此時的泡沫體積與100之比即為起泡性。然后靜置樣品30 min，再一次測量泡沫的總體積[22]。靜置后的泡沫體積與均質(zhì)停止時的泡沫體積之比即為泡沫穩(wěn)定性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖

數(shù)據(jù)采用Origin9.1軟件進(jìn)行計(jì)算繪圖。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析。數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白濃度的測定

蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 BCA法測定蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein concentration determined by BCA method

以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，OD562為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.897 37x+0.078 46（R2=0.996 78），由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到分離蛋白樣品中蛋白質(zhì)濃度為34.8 mg/mL。

2.2 水解度的測定

核桃分離蛋白水解時間與水解度的關(guān)系如圖2所示。

圖2 核桃分離蛋白水解時間與水解度的關(guān)系Fig.2 The relationship between hydrolysis time and hydrolysis degree of walnut protein isolate

由圖2可知，運(yùn)用pH-stat法測定核桃粕蛋白的水解度，用堿性蛋白酶酶解核桃餅粕蛋白質(zhì)，在前80 min時，水解速度較快，隨著時間的延長，水解度增長速度變緩；當(dāng)酶水解時間達(dá)到120 min時，達(dá)到最高值，此時為19.4%，此后時間延長，其水解度不再變化。即120 min為最大酶解程度所需的最短時間。由于在120 min以后水解度未發(fā)生改變，20 min和40 min對應(yīng)的水解度無顯著性差異，100 min和120 min對應(yīng)的水解度無顯著性差異，因此綜合考慮之后，選取了 0、40、80、120 min 4個梯度進(jìn)行功能性質(zhì)的測定。

2.3 持水性的測定

不同水解度的核桃分離蛋白持水性如圖3所示。

圖3 核桃分離蛋白水解時間與持水性的關(guān)系Fig.3 The relationship between hydrolysis time of walnut protein isolate and water retention

由圖3可知，酶解時間0～120 min，核桃分離蛋白的持水性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。酶解0～80 min，隨著水解時間的延長，水解度逐漸增大，酶解80min時，分離蛋白持水性最佳。酶解時間超過80 min，持水性反而會下降。這是因?yàn)楹颂业鞍捉?jīng)過蛋白酶水解，逐漸水解為低分子量的多肽，導(dǎo)致多肽鏈伸展、空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，持水性提高。當(dāng)水解度過大時，多肽段變得很小，極易溶解于水中，不利于形成蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，持水性下降[12，23]。因此，持水性與水解度有一定的關(guān)系，持水性受多肽溶解的影響而變小。

2.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

不同水解度的核桃分離蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性如圖4所示。

由圖4分析得出，酶解0～80 min，隨著水解時間的增加，乳化性一直上升。酶解時間80 min～120 min，隨著酶解程度的增大，乳化性卻表現(xiàn)出下降的趨勢。在一定的水解度下，核桃分離蛋白經(jīng)酶解后，變?yōu)樾》肿?，其中一些露在外的親油基團(tuán)使其對油脂分子的吸收能力變大，溶液中的氨基酸迅速轉(zhuǎn)移到油和水的界面上，促進(jìn)乳濁體系的形成，才會導(dǎo)致乳化性增強(qiáng)。后期隨著水解度持續(xù)增大，蛋白水解超過極限，由于此時過度水解導(dǎo)致蛋白質(zhì)的內(nèi)部遭到破壞，與脂質(zhì)分子的組合能力降低，乳化性下降。

圖4 核桃分離蛋白的水解時間與乳化性、乳化穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.4 The relationship between hydrolysis time of walnut protein isolate and emulsification property and stability

酶解0～120 min乳化穩(wěn)定性隨水解度的增大而一直升高，且開始上升趨勢較緩，后來上升趨勢較快。這是因?yàn)橛H油基團(tuán)對油脂分子形成了一定的屏障作用，乳化穩(wěn)定性隨著水解度的變大而增強(qiáng)，即趨勢一致成正比。另外，由于受分子溶解性的作用，形成了界面膜以增強(qiáng)小分子的乳化穩(wěn)定性。此外，又由于蛋白質(zhì)是帶電的，油分子被靜電作用力吸到一側(cè)阻礙了運(yùn)動，從而提高了乳化穩(wěn)定性。

2.5 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定

不同水解度的核桃分離蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性如圖5所示。

圖5 核桃分離蛋白水解時間與起泡性及泡沫穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.5 The relationship between hydrolysis time of walnut protein isolate and foaming property and foam stability

由圖5可知，核桃分離蛋白的起泡性在酶解0～120 min內(nèi)，隨水解時間的延長，一直呈增大的趨勢。未進(jìn)行酶解時，蛋白質(zhì)起泡性最小，為40.0%，在120 min時起泡性達(dá)到最大值為85.0%。說明隨著核桃分離蛋白水解度的增大，酶解產(chǎn)物的起泡性逐漸增大。當(dāng)水解時間大于80 min，起泡性增長速度變快，這是因?yàn)槊附夂?，蛋白質(zhì)分子的各條肽鏈?zhǔn)嬲归_來，通過分子之間的作用力使膜形成，此時酶解使分子之間的空間結(jié)構(gòu)展開，親脂性基團(tuán)露出，將空氣包埋在水中，液泡表面張力減小，氣泡穩(wěn)定性隨之變大，促進(jìn)表面膜形成后，蛋白的起泡性得以增大。

隨著酶解時間的延長，核桃分離蛋白水解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性逐漸減小，這是因?yàn)楦叨让附夂笫巩a(chǎn)物中形成較多的小分子多肽，疏水基團(tuán)暴露在外導(dǎo)致小的那一部分肽鏈無法使液體膜達(dá)到穩(wěn)定，穩(wěn)定性開始下降，也有一部分原因是隨著酶解的逐步進(jìn)行，電荷有所增加，蛋白質(zhì)分子在氣液表面的吸附作用被阻礙，從而降低了泡沫穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

將核桃餅粕用堿性蛋白酶水解，通過改變酶解的時間制成不同水解度的分離蛋白，研究水解度對其功能特性的影響。經(jīng)研究得出，水解度可提高也可削弱某些功能特性。在酶解0～120 min內(nèi)，起泡性及乳化穩(wěn)定性隨酶解程度增大而變大，持水性及乳化性隨酶解程度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨向，在中間的某個水解度達(dá)到最大值。泡沫穩(wěn)定性隨酶解程度增大而變小。