国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

番石榴葉抑制酪氨酸酶作用機(jī)制研究

2020-10-18 08:30:58孫曉夢(mèng)林東明楊弘王禕王凱晗王春麗
食品研究與開(kāi)發(fā) 2020年19期
關(guān)鍵詞:番石榴初速度多巴

孫曉夢(mèng),林東明,楊弘,王禕,王凱晗,王春麗,*

(1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海200237;2.制藥工程與過(guò)程化學(xué)教育部工程研究中心,上海200237;3.上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200237)

從酪氨酸和L-多巴代謝為真黑素和褐黑素,作為唯一明確的黑色素代謝酶,酪氨酸酶在黑色素形成過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)中,發(fā)揮著至關(guān)重要的限速作用[1]。應(yīng)用酪氨酸酶抑制劑,通過(guò)抑制酪氨酸酶的活性,阻斷黑色素的合成反應(yīng)鏈,減少其在皮膚內(nèi)的生成從而達(dá)到祛斑增白的效果。因此,美白是酪氨酸酶抑制劑主要應(yīng)用方向之一。美白化妝品市場(chǎng)近年來(lái)日趨活躍,銷量快速增長(zhǎng)。美白劑按來(lái)源分合成、生物發(fā)酵和動(dòng)植物提取,其中由合成品及生物發(fā)酵所制得的美白劑,由于純度高、顏色淺和性能穩(wěn)定而占據(jù)美白劑主要市場(chǎng)。而植物來(lái)源的美白劑用于迎合人們的安全需求而成為近年來(lái)研究的焦點(diǎn)。在化妝品活性成分篩選時(shí),獲得兼具美白與抗氧化作用的活性物質(zhì)是理想目標(biāo),即酪氨酸酶抑制劑同時(shí)表現(xiàn)出良好的清除體內(nèi)自由基的作用,如熊果苷、VC等[2]。目前,已有研究表明番石榴葉中黃酮類化合物具有顯著抗氧化活性[3],因此,經(jīng)初篩研究,在證實(shí)番石榴葉水提液兼具良好的酪氨酸酶抑制作用以及自由基清除作用后,本文旨在探究番石榴葉水提液抑制酪氨酸酶的作用機(jī)制。一般來(lái)說(shuō),藥物對(duì)酪氨酸酶抑制機(jī)制可以分為競(jìng)爭(zhēng)型、非競(jìng)爭(zhēng)型、混合型或者可逆型、不可逆型[4],本文將通過(guò)試驗(yàn)探究其抑制機(jī)制的具體類型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)材料與儀器見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)材料與儀器Table 1 The main raw material and equipment

1.2 試驗(yàn)方案

1.2.1 提取液制備

番石榴葉粉碎過(guò)30目篩,準(zhǔn)確稱取5.0 g,以水為溶劑,取料液比 1 ∶10(g/mL),加熱回流 1.0 h,收集上層清液。濾渣加入同體積水,繼續(xù)加熱回流1.0 h。合并兩次提取液,沉清,抽濾,所得濾液定容至100 mL的容量瓶中[5]。制得中藥(生藥)提取液的濃度約為50 mg/mL。

1.2.2 初速度值計(jì)算

試驗(yàn)中分別用 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L 的不同濃度的L-多巴溶液,同時(shí)改變番石榴葉水提物的濃度 0、2、4、6、8、10 mg/mL,按體積比 1 ∶1 ∶1 要求加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、L-多巴溶液、番石榴葉提取液,28℃下水浴10 min后,加入酪氨酸酶,用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析,繪制出酶反應(yīng)體系隨時(shí)間的線性增長(zhǎng)曲線,其斜率為初始速度值。取平行試驗(yàn)3次的平均值。

1.2.3 抑制類型判定

動(dòng)力學(xué)研究表明,酶抑制機(jī)制類型不同,其動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化也是有規(guī)律的,表現(xiàn)在米氏常數(shù)Km值以及最大反應(yīng)速率Vm值[6]。由動(dòng)力模型Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程[7]繪制圖,競(jìng)爭(zhēng)抑制類型表現(xiàn)為直線與橫坐標(biāo)軸相交。抑制劑濃度越大,直線的斜率越大,而縱軸的截距保持不變。即動(dòng)力學(xué)參數(shù)表現(xiàn)為Km值增加并且Vm值保持不變。非競(jìng)爭(zhēng)型抑制類型也表現(xiàn)為一組交點(diǎn)在橫坐標(biāo)軸上的直線[8],但抑制劑濃度越大,Km值不變,Vm值變小?;旌闲鸵种祁愋捅憩F(xiàn)為一組交點(diǎn)在第二象限的直線抑制劑濃度增大時(shí),Km值增大,Vm值減小。

1.2.4 抑制常數(shù)測(cè)定

酶活力未改變,L-多巴濃度發(fā)生變化,測(cè)定不同濃度番石榴葉水提物對(duì)酶活力的影響。以L-多巴濃度為橫坐標(biāo)、酪氨酸酶初速度為縱坐標(biāo)繪制關(guān)系圖[9],縱坐標(biāo)繪制一組Lineweaver-Burk雙倒數(shù)直線圖,其中橫坐標(biāo)為L(zhǎng)-多巴濃度的倒數(shù)、縱坐標(biāo)為酪氨酸酶初速度的倒數(shù),比較Km值和Vm值的變化規(guī)律,由此判斷抑制機(jī)制類型。以番石榴葉水提物濃度為橫坐標(biāo)、米氏方程斜率為縱坐標(biāo)作圖,抑制常數(shù)KI為擬合的直線斜率;以番石榴葉水提物濃度為橫坐標(biāo)、米氏方程截距為縱坐標(biāo)作圖,抑制常數(shù)KIS為擬合直線的截距[10]。

目前,競(jìng)爭(zhēng)型、非競(jìng)爭(zhēng)型以及混合型抑制類型的動(dòng)力學(xué)模型研究較為完善[11],各動(dòng)力學(xué)模型Lineweaver-Burk方程分別為:

式中:CI為酪氨酸酶抑制劑濃度,mg/mL;CS為底物(L-多巴)濃度,mmol/L;Km為表觀米氏常數(shù),mmol/L;KI為酪氨酸酶抑制劑對(duì)酶的抑制常數(shù),mg/mL;KIS為酪氨酸酶抑制劑對(duì)酶與底物的絡(luò)合物的抑制常數(shù),mg/mL;Vm為酪氨酸酶催化氧化的最大反應(yīng)速率,△A/min;V為酪氨酸酶催化氧化的反應(yīng)速率,△A/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶活力測(cè)定

番石榴葉水提液濃度對(duì)酪氨酸酶的影響見(jiàn)圖1。

圖1 番石榴葉水提液濃度對(duì)酪氨酸酶的影響Fig.1 The effect of guava leaf water extract on activity of tyrosinase

固定L-多巴濃度和酶活力,用1.2.3方法測(cè)定不同濃度番石榴葉水提物對(duì)酪氨酸酶活力的影響,以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo),繪制酪氨酸酶動(dòng)力學(xué)曲線[12]。由圖1可知,隨著番石榴葉水提物的濃度逐漸增大,直線斜率逐漸減小,表明L-多巴被酪氨酸酶催化氧化的速率逐漸減小,從而證明了番石榴葉水提物對(duì)酪氨酸酶具有一定的抑制作用。

2.2 初速度值

改變底物L(fēng)-多巴的濃度以及番石榴葉水提物的濃度,獲得酪氨酸酶催化氧化進(jìn)程動(dòng)力學(xué)曲線,通過(guò)其斜率來(lái)計(jì)算初速度值[13],結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同的底物濃度和提取物濃度下的酶反應(yīng)初速度Table 2 Initial reaction velocity of tyrosinase-catalyzed reaction at different substrate concentrations and different extracts concentrations

2.3 抑制類型判定

基于表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù),繪制了以提取物濃度為橫坐標(biāo),初始速度為縱坐標(biāo)的關(guān)系曲線如圖2。

圖2 不同濃度的番石榴葉提取液對(duì)酪氨酸酶初速度的關(guān)系圖Fig.2 The effect on different concentrations of guava leaf water extract on tyrosinase initial reaction velocity

從圖2中可以看出,初速度值隨著L-多巴濃度的增大而增大,隨著番石榴葉水提物濃度的增大而減小。結(jié)果表明,隨著L-多巴濃度的增加,番石榴葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用減弱,因而可以推斷該抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)型[14],即酪氨酸酶抑制劑和底物相互競(jìng)爭(zhēng)以減弱酶催化氧化多巴的反應(yīng)進(jìn)程。

基于表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù),繪制以L-多巴濃度為橫坐標(biāo)、初速度為縱坐標(biāo)的關(guān)系曲線,如圖3。

圖3 不同濃度的底物L(fēng)-多巴對(duì)酪氨酸酶初速度的關(guān)系圖Fig.3 The effect on different concentrations of substrate on tyrosinase initial reaction velocity

從圖3中可以看出,底物濃度越大,酶活力越大,而不同濃度的番石榴葉水提物對(duì)不同濃度底物的酪氨酸酶均有不同程度的抑制作用。當(dāng)番石榴葉水提物濃度超過(guò)4 mg/mL時(shí),酶起止活力變化幅度逐漸減小,酶與番石榴葉水提物之間的相互作用趨于平穩(wěn)。結(jié)果表明,番石榴葉水提取物是通過(guò)抑制酪氨酸酶的活性而不是直接使酶失活來(lái)降低其催化氧化效率。因此,可以推斷番石榴葉水提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用是可逆的[15]。

2.4 動(dòng)力學(xué)分析

將表2中數(shù)據(jù)取倒數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換,得表3。

表3 番石榴葉水提物抑制酪氨酸酶的動(dòng)力學(xué)分析Table 3 Dynamic analysis of diphenolase inhibited by guava leaf water extract

以L-多巴濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)、初速度值的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制出番石榴葉水提物抑制酪氨酸酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)直線,見(jiàn)圖4。

由圖4可看出直線在第二象限一個(gè)交點(diǎn),并且番石榴葉水提物濃度越大,直線斜率Km越大,直線截距Vm越小,由酶抑制類型定律可知番石榴葉水提物抑制酪氨酸酶的類型為混合型[16],即抑制劑既與底物和酪氨酸酶的絡(luò)合物結(jié)合,也與底物競(jìng)爭(zhēng)。

2.5 抑制常數(shù)測(cè)定

由圖4得到各組直線的斜率與截距,經(jīng)過(guò)擬合得到不同濃度番石榴葉水提物的米氏方程,其動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。番石榴葉水提物的酶抑制常數(shù)Kl的測(cè)定見(jiàn)圖5,番石榴葉水提物的酶抑制常數(shù)Kls的測(cè)定見(jiàn)圖6。

圖4 番石榴葉抑制酪氨酸酶的動(dòng)力學(xué)分析圖Fig.4 Dynamic analysis of diphenolase inhibited by guava leaf water extract diphenolase

表4 番石榴葉水提物抑制酪氨酸酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of diphenolase inhibited by guava leaf water extract

圖5 番石榴葉水提物的酶抑制常數(shù)K1的測(cè)定Fig.5 Determination of inhibitory constant K1by guava leaf water extract on diphenolase

圖6 番石榴葉水提物的酶抑制常數(shù)KIS的測(cè)定Fig.6 Determination of inhibitory constant KISby guava leaf water extract on diphenolase

表4可知,抑制常數(shù)KI=13.02 mg/mL、KIS=3.98 mg/mL,KI與KIS可以通過(guò)圖5的直線斜率與圖6的直線截距分別得出。KI值大于KIS,說(shuō)明番石榴葉水提物對(duì)酪氨酸酶和底物多巴的絡(luò)合物的抑制作用強(qiáng)于對(duì)游離態(tài)的酪氨酸酶的抑制作用[17]。各米氏方程的Km與Vm值由混合型抑制模型方程式(3)得出。由現(xiàn)有試驗(yàn)數(shù)據(jù)并結(jié)合已知的藥物對(duì)酪氨酸酶抑制的機(jī)制,隨著番石榴葉水提物濃度增大,Km增大,Vm一定程度減小,說(shuō)明番石榴葉水提物抑制酪氨酸酶的類型較符合混合型[18]。

3 結(jié)論

本文考察了在番石榴葉水提物的影響下酪氨酸酶催化氧化的反應(yīng)進(jìn)程,并且探討了番石榴葉水提物和底物L(fēng)-多巴在不同濃度下分別對(duì)酪氨酸酶的初速度的影響,判斷了番石榴葉水提物對(duì)酪氨酸酶的抑制類型。

3.1 番石榴葉水提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用顯著

由番石榴葉水提物對(duì)酪氨酸酶活力影響的曲線圖可知,反應(yīng)進(jìn)程直線的斜率隨著番石榴葉水提物濃度的增大而明顯減小,即酪氨酸酶的催化活性隨著酶抑制劑濃度的增大而明顯降低,表明番石榴葉水提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用較為顯著。

3.2 番石榴葉水提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用可逆

由不同濃度的番石榴葉水提物、不同濃度的底物L(fēng)-多巴分別與酪氨酸酶初速度的關(guān)系圖可知,酪氨酸酶初速度值在底物濃度一定的情況下隨著番石榴葉水提物濃度的增大而減小,在抑制劑濃度一定的情況下隨著底物L(fēng)-多巴濃度的增大而增大,酪氨酸酶并沒(méi)有因?yàn)橐种苿┑拇嬖诙Щ睿砻鞣袢~水提物通過(guò)降低酪氨酸酶的催化氧化反應(yīng)活性來(lái)限制黑色素生成過(guò)程中的反應(yīng)速率,并且抑制作用是可逆性的[19]。一般中藥類型的酪氨酸酶抑制劑主要以可逆型為主,因其表征為解離平衡時(shí)酪氨酸酶抑制劑與酶或者酶和底物的絡(luò)合物之間相互結(jié)合的可逆反應(yīng)[20]。

3.3 番石榴葉水提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用類型為混合型

由番石榴葉水提物抑制酪氨酸酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)直線圖可知,米氏方程直線的斜率隨著番石榴葉水提物濃度的增大而增大,米氏方程直線的截距隨著番石榴葉水提物濃度的增大而減小,即抑制劑濃度增大時(shí),Km值增大,Vm值減小,且該組直線在第二象限相交于一點(diǎn),完全符合混合型酪氨酸酶抑制特征,即番石榴葉水提物既可以與酪氨酸酶結(jié)合,也可以與酶和底物的絡(luò)合物結(jié)合,從而抑制催化氧化反應(yīng)進(jìn)程而發(fā)揮美白作用。此外由抑制常數(shù)KI>KIS可知,番石榴葉水提物對(duì)酪氨酸酶和底物多巴的絡(luò)合物的抑制作用強(qiáng)于對(duì)游離態(tài)的酪氨酸酶的抑制作用。

猜你喜歡
番石榴初速度多巴
觀察多巴胺聯(lián)合多巴酚丁胺治療新生兒肺炎的臨床療效
中國(guó)番石榴主要品種
番石榴的選購(gòu)與保存
益壽寶典(2018年31期)2018-11-19 06:39:26
AGPM控制系統(tǒng)分析及最適初速度優(yōu)化算法研究
楊仲鴻《摩些文多巴字及哥巴字漢譯字典》審查經(jīng)過(guò)補(bǔ)說(shuō)
草莓番石榴果實(shí)化學(xué)成分的研究
中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:41
勻變速直線運(yùn)動(dòng)的速度與位移的關(guān)系
關(guān)于瓦斯放散初速度實(shí)驗(yàn)留樣再測(cè)的探討
顫止方聯(lián)合多巴絲肼片治療帕金森病40例
番石榴和番石榴葉加工研究進(jìn)展
马鞍山市| 修水县| 邯郸市| 虎林市| 泊头市| 湟源县| 诸城市| 堆龙德庆县| 夏河县| 卢氏县| 贺兰县| 马鞍山市| 合作市| 泗阳县| 邵东县| 长寿区| 青河县| 清流县| 盘锦市| 吉林省| 宿迁市| 海林市| 凤台县| 怀宁县| 株洲市| 尉氏县| 邯郸市| 璧山县| 绥芬河市| 昭觉县| 安陆市| 修水县| 长治县| 栖霞市| 皋兰县| 大名县| 灌阳县| 乌恰县| 白朗县| 临漳县| 顺昌县|