雷霽卿，倪維鞠，張放，王瑞

（貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽550005）

植物內(nèi)生真菌是指植物生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各組織器官內(nèi)的真菌[1]。可通過產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)、水解酶、植物生長調(diào)節(jié)劑、植物生長激素類物質(zhì)，與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式拮抗植物病害[2-3]。分離純化內(nèi)生真菌并分析其對植株病原體的生物抗性，可以簡單有效的篩選出具有抗菌活性的菌株，進一步鑒定其抗菌活性成分可以為開發(fā)綠色生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)[4-8]。

截止2019年底，貴州藍莓種植面積已達18萬畝，隨著產(chǎn)量增大，貯運期藍莓果實腐敗造成的經(jīng)濟損失及大量使用化學(xué)農(nóng)藥引起的農(nóng)殘超標(biāo)問題不容忽視，開發(fā)綠色農(nóng)藥或綠色保鮮劑已經(jīng)成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的一大問題。而目前越橘屬植物內(nèi)生真菌及其生物抗性的研究主要集中于藥用越橘屬植物內(nèi)生真菌及其對人類致病菌抗菌活性[9-13]。因此，本研究選擇藍莓作為研究材料，分離純化藍莓莖、葉及果實中內(nèi)生真菌并通過對峙實驗及菌絲生長試驗初步研究藍莓內(nèi)生真菌生物拮抗活性，以期為開發(fā)綠色生物農(nóng)藥及保鮮劑提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“粉藍”藍莓樹葉、樹枝及果實：貴州省麻江縣藍莓種植基地；藍莓果實病害菌（青霉Penicillium、枝孢屬Cladosporium、尖小叢殼菌Glomerella acutata、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、葡萄球菌Staphylocccus）：貴州省果品創(chuàng)新中心，儲存于貴陽學(xué)院；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextroseagar，PDA）：青島海博生物技術(shù)有限公司；乙酸乙酯：天津市富宇精細化工有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（SK8259-50次）、DNA Marker DL2000、引物 ITS1/ITS4：生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

DH5000BII電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；Microfug?20Rcentrifuge高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；T100TMThermal Cycler PCR：美國伯樂有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 內(nèi)生真菌的分離純化

藍莓莖、葉、果實采回后自來水沖洗除去表面泥土，無菌濾紙吸干表面水分；各組織依次用0.1%升汞、75%酒精浸泡消毒各3 min，用無菌水漂洗3次，無菌濾紙吸干表面水分，置于超凈工作臺吹干。用無菌剪刀將植物組織剪切為0.2 cm×0.2 cm組織塊，每4個組織塊一組，接種于PDA平板，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌絲從組織塊周圍長出后，挑取單菌落轉(zhuǎn)移至另一PDA平板，連續(xù)傳代培養(yǎng)至菌落形態(tài)單一。根據(jù)菌落培養(yǎng)特征將分離純化的內(nèi)生真菌劃分為不同的形態(tài)型[14]。

1.3.2 rDNA-ITS序列擴增

使用上海生工Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（CAS B518259）提取內(nèi)生真菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用rDNA-ITS序列通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′）進行rDNA-ITS序列擴增。20 μL 反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10 μL、DNA 模板1 μL、ITS1 和 ITS4 引物各 1 μL，ddH2O 補足至 20 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min[15]。

1.3.3 序列分析

PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結(jié)果利用美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的多序列比對工具堿基局部對準(zhǔn)檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）在序列數(shù)據(jù)庫GenBank中作相似差異性分析，下載同源性較高的序列，使用最大似然法（maximum likelihood，MI）分析親緣關(guān)系。MI分析采用MEGA7進行，bootstrap重復(fù)值1500、選用Kimura 2-parameter model、得到系統(tǒng)發(fā)育樹后使用iTOL v4在線軟件進行整理。將病原菌的親緣分析結(jié)果與其形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀結(jié)合起來對其進行鑒定[16]。

1.3.4 內(nèi)生真菌拮抗特性篩選

采用平板對峙法分析藍莓內(nèi)生真菌對藍莓病害菌拮抗特性。將內(nèi)生真菌菌餅接種至PDA平板中央，在其左右等徑3 cm處各接種1病原真菌菌餅作為處理組；另取PDA平板在距離平板中心左右3 cm各接種1病原真菌菌餅作為對照；處理組與對照組均接種5個平行，將所有接種PDA平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待對照組病原菌生長至平板中央時，測量各病原真菌菌落生長半徑。根據(jù)以下公式計算抑菌率：抑菌率/%=[（對照組半徑-處理組半徑）/對照組半徑]×100[17]。

1.3.5 內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物提取

平板對峙實驗篩選出的內(nèi)生真菌在PDA平板上劃線培養(yǎng)3 d～4 d，平板上挑取孢子接種于液體培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)3 d，得到種子液。種子液以15%的比例接種于裝有500 mL液體培養(yǎng)基錐形瓶中，放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)28 d。發(fā)酵液過濾，濾液用相同體積乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯層45℃減壓蒸干，使用 10%二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）配置成10 mg/mL儲存液備用[18]。

1.3.6 內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物拮抗特性篩選

用菌絲生長法測定該菌株次級代謝產(chǎn)物對病原真菌菌絲生長的抑制活性。無菌條件下，次級代謝產(chǎn)物粗提取制作的含藥PDA平板中央接種病原真菌菌餅作為試驗組，無藥PDA平板接種病害菌作為陰性對照，所有處理和對照設(shè)置3個平行，置于28℃恒溫培養(yǎng)。待陰性對照長滿培養(yǎng)皿時，分別測量各病原菌的生長量，并根據(jù)以下公式計算抑制率：抑菌率/%=[1-（試驗組菌斑直徑÷陰性對照的菌斑直徑）]×100[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS statistics 22軟件（International Business Machines Corporation）對試驗數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 藍莓內(nèi)生真菌分離純化

藍莓內(nèi)生真菌的鑒定分布見表1。

從貴州麻江藍莓種植基地的“粉藍”藍莓的不同部位健康組織（莖、葉、果實）的81個表面消毒組織塊中共分離出41株內(nèi)生真菌；莖、葉、果實各分離到8、14、19株，分離率分別為29.63%、51.85%、70.37%。形態(tài)學(xué)分類鑒定結(jié)果表明：41株內(nèi)生真菌隸屬于子囊菌門（Ascomycota）的 8個菌屬，其中釘孢屬（Passalora sp.）為優(yōu)勢屬，占總數(shù)的26.8%；莖中發(fā)現(xiàn)枝孢屬（Cladosporium sp.）、球腔菌屬（Mycosphaerella sp.）、釘孢屬（Passalora sp.）及刺盤孢屬（Colletotrichum sp.），葉中發(fā)現(xiàn)枝孢屬（Cladosporium sp.）、球腔菌屬（Mycosphaerella sp.）、小球腔菌屬（Leptosphaeria sp.）及釘孢屬（Passalora sp.），月盾霉屬（Peltaster sp.）、間座殼屬（Diaporthe sp.）及蒼白尾孢屬（Pallidocercospora sp.）則僅分布在果實中，內(nèi)生真菌的分布呈現(xiàn)器官特異性。Z J等[20]從云南野生越橘屬植物中分離純化出374株內(nèi)生真菌，隸屬于子囊菌門25個屬，果實及莖內(nèi)生真菌分布相似，與樹葉內(nèi)生真菌分布差異大，研究結(jié)果與本試驗類似，但與規(guī)?；斯しN植基地藍莓樣品相比，野生越橘屬植物內(nèi)生真菌多樣性更為豐富。

表1 藍莓內(nèi)生真菌的鑒定分布Table 1 Identification and distribution of endophytic fungi isolated from Blueberry

2.2 藍莓內(nèi)生真菌菌株生物拮抗特性初步分析

將41株藍莓內(nèi)生真菌對5種藍莓病害菌進行對峙試驗，見表2。

表2 藍莓內(nèi)生真菌菌株抑菌活性鑒定Table 2 Inhibitory activity screening of endophytic fungal strain isolated from Blueberry

續(xù)表2 藍莓內(nèi)生真菌菌株抑菌活性鑒定Continue table 2 Inhibitory activity screening of endophytic fungal strain isolated from Blueberry

對峙實驗結(jié)果表明，有16株藍莓內(nèi)生真菌對至少1種藍莓病害菌有抑菌活性，占分離菌株總數(shù)的39.02%；對青霉（Penicillium sp.）、枝孢屬（Cladosporium sp.）、尖小叢殼菌（Glomerella acutata）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、葡萄球菌（Staphylococcus）表現(xiàn)出拮抗活性的內(nèi)生真菌分別有9株、12株、13株、7株和9株；其中，對青霉（Penicilliumsp.）、枝孢屬（Cladosporiumsp.）、尖小叢殼菌（Glomerella acutata）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、葡萄球菌（Staphylococcus sp.）拮抗活性最強的菌株分別為BF41抑制率21.143 8%±2.716 30%、BF27抑制率 54.236 1%±1.515 6%、BB01抑制率58.674 0%±2.639 8%、BL22抑制率 24.471 8%±1.235 2%和BF41抑制率61.421 9%±3.162 4%。內(nèi)生真菌 BB01、BL22、BF27、BF40 及 BF41 對 5 個菌屬藍莓病害菌均表現(xiàn)出較強抑制作用，BF41分類鑒定為刺盤孢屬Colletotrichum sp.，BF40分類鑒定為蒼白尾孢屬 Pallidocercospora sp.，BL22、BF27、BB01 分類鑒定為枝孢菌屬Cladosporium sp.。

2.3 藍莓內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物生物拮抗特性初步分析

為進一步了解內(nèi)生真菌 BB01、BL22、BF27、BF40及BF41次級代謝產(chǎn)物拮抗特性，使用乙酸乙酯提取了內(nèi)生真菌發(fā)酵液中的次級代謝產(chǎn)物粗提取物，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后將其配成10 mg/mL儲存液，使用菌株代謝產(chǎn)物制作濃度為 500、250、125、62.5、31.25 μg/mL 的系列含藥平板用于菌絲生長試驗，試驗結(jié)果見圖1。

圖1 藍莓內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物抑菌活性Fig.1 Inhibitory activity of secondary metabolites of endophytic fungi in blueberry

由圖1可見，高濃度次級代謝產(chǎn)物含藥平板（500μg/mL）對各病原菌均有良好的抑制效果（生長抑制率均超過90%）；5種次級代謝產(chǎn)物對青霉及灰葡萄孢菌的拮抗活性隨濃度下降均顯著降低（濃度低于62.5 μg/mL時，對青霉、灰葡萄孢菌抑制率均低于35%，濃度低于31.25 μg/mL時，對青霉、灰葡萄孢菌抑制率均低于15%）；隨濃度降低對枝孢屬、尖小從殼菌、葡萄菌仍具有較強拮抗活性的次級代謝產(chǎn)物分別是BF27[31.25μg/mL含藥平板上菌絲生長抑制率為56.2865%±3.616 2%]、BB01[31.25 μg/mL 含藥平板上菌絲生長抑制率為 40.808 6%±0.65 9%]、BF41[31.25 μg/mL 含藥平板上菌絲生長抑制率仍為53.28 5%±2.1718%]。

過去研究證明枝孢屬內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生枝孢素，其可能是一種新型的光譜抗細菌、抗真菌藥物[21]；最新研究表明，海藻內(nèi)生枝孢屬真菌可產(chǎn)生納米銀離子、納米金離子，其表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性及抗菌活性[22-23]；Li等從紅花青藤刺盤孢屬內(nèi)生真菌Colletotrichum gloeosporioidesB12中分離出兩種γ-丁內(nèi)酯對4種病害真菌（B.cinerea，S.sclerotiorum，F(xiàn).solaniandR.cerealis）的最小抑菌濃度為128 μg/mL[24]，LuoY等從紅樹林植物內(nèi)生真菌Colletotrichum gloeosporioides中分離出3種新的聚酮類化合物具有良好的抗細菌活性[25]。本研究中枝孢屬內(nèi)生真菌（BL22、BF27、BB01），刺盤孢屬內(nèi)生真菌（BF41）及蒼白尾孢屬內(nèi)生真菌（BF40）次級代謝產(chǎn)物粗提取物含藥平板濃度為500 μg/mL時，對5種病害菌菌絲生長抑制率均超過90%，表現(xiàn)出顯著的抗病害真菌活性，但其抗菌機制有待進一步研究。

2.4 具有生物拮抗活性藍莓內(nèi)生真菌rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

以5株內(nèi)生真菌基因組DNA為模板，通過PCR擴增得到500bp～550bp的rDNA-ITS序列，將測序得到的rDNA-ITS基因序列提交GeneBank獲得登錄號MN814007、MN814008、MN814009、MN814010及 MN814011?；趓DNA-ITS序列的藍莓拮抗內(nèi)生真菌聚類分析見圖2。

圖2 基于rDNA-ITS序列的藍莓拮抗內(nèi)生真菌聚類分析Fig.2 Phylogenetic analysis of antagonistic endophytic fungi in blueberry based on rDNA-ITS sequence

將基因序列于GeneBank數(shù)據(jù)庫Blast比對后，下載同源性超過90%的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，BF41鑒定為刺盤孢屬Colletotrichum sp.，BF40鑒定為蒼白尾孢屬 Pallidocercospora sp.，BL22、BF27、BB01 鑒定為枝孢菌屬Cladosporium sp.，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，BB01、BL22、BF27、BF40 及 BF41 菌株均為該屬新的菌種。

3 結(jié)論

本研究從貴州麻江藍莓種植基地的“粉藍”藍莓的健康組織（莖、葉、果實）中分離出41株內(nèi)生真菌，經(jīng)分類鑒定，隸屬于8個菌屬，優(yōu)勢屬為釘孢屬（Passalora sp.）；與5株病害菌進行對峙實驗分析內(nèi)生真菌拮抗特性發(fā)現(xiàn)，有16株內(nèi)生真菌對至少1種病害菌具有抑菌活性，其中 BB01、BL22、BF27、BF40 及 BF41 可抑制全部 5 種病害菌生長；提取 BB01、BL22、BF27、BF40及BF41內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物粗提取物對病害菌進行菌絲生長試驗，發(fā)現(xiàn)次級代謝產(chǎn)物粗提取物含藥平板濃度為500 μg/mL時對5種病害菌菌絲生長抑制率均超過90%，表現(xiàn)出顯著的抗病害真菌活性；采用PCR擴增內(nèi)生真菌基因組rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，BF41鑒定為刺盤孢屬Colletotrichum sp.，BF40鑒定為蒼白尾孢屬 Pallidocercospora sp.，BL22、BF27、BB01則鑒定為枝孢菌屬Cladosporium sp.，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致；將測序得到的rDNA-ITS基因序列提交GeneBank獲得登錄號MN814007、MN814008、MN814009、MN814010 及 MN814011，BB01、BL22、BF27、BF40 及BF41菌株均為該屬新的菌種。