于洋，馮毅，宋宏立，吳禹昊，逄曉陽，馬青，*

（1.寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，寧夏銀川750002；2.寧夏鹽池縣農(nóng)牧局農(nóng)經(jīng)站，寧夏鹽池751500；3.青島農(nóng)業(yè)大學海都學院，山東萊陽265200；4.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193）

鹽池灘羊是一種獨特的綿羊地方品種，主要生長在中國寧夏鹽池縣。灘羊肉鮮紅色，有均勻的脂肪分布、細膩的肉質(zhì)和不腥不膻的品質(zhì)，一直被認為是高品質(zhì)的羊肉代表[1]。近年來，鹽池灘羊年飼養(yǎng)量穩(wěn)定在300萬只左右，年出欄灘羊育肥羊達180萬只[2]。灘羊尾巴是灘羊的儲能器官之一，成年灘羊尾巴的重量約為1.5 kg～2.5 kg，羊尾的主要成分是脂肪[3]，由于其食用價值低，且目前缺乏灘羊尾脂的高值化精深加工技術(shù)，導致作為屠宰加工副產(chǎn)物的灘羊尾脂利用率極低，少數(shù)用于制作羊肉串和調(diào)味品，灘羊尾脂每年都會產(chǎn)生大量堆積，既造成資源浪費又導致環(huán)境污染。

研究表明，羊尾脂中含有大量高附加值的脂肪酸，尤其是對人體有益的共軛亞油酸含量十分豐富[4]。共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是亞油酸的同分異構(gòu)體，是一種天然存在于各種生物體內(nèi)的物質(zhì)，目前普遍認為亞油酸在反芻動物瘤胃中被異構(gòu)化酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)楣曹梺営退?，而人體自身不能合成[5]，必須從CLA含量較高的牛、羊等反芻動物或CLA營養(yǎng)補充劑中攝取?，F(xiàn)已證實CLA具有抗癌[6]、抗動脈粥樣硬化[7]、抗肥胖的功效[8]、同時還具有調(diào)節(jié)骨密度[9]、增強免疫力[10]、預防糖尿病[11]等功能，是繼α-亞麻酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）之后又一種極其重要的功能性脂類物質(zhì)，是美國食品與藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）承認的食品補充劑。

目前CLA已廣泛用于食品[12]、制藥[13]和飼料行業(yè)[14]。CLA在動物產(chǎn)品和植物產(chǎn)品中普遍存在，并且反芻動物產(chǎn)品中的CLA含量更豐富[15]。國內(nèi)外學者很早就關(guān)注了反芻動物產(chǎn)品中的CLA。楊晶等研究了不同品種不同部位羊肉中CLA的含量，結(jié)果表明羊的品種和部位都對羊肉中CLA的含量有一定影響，羊脂肪中的CLA含量顯著高于羊肉[16]。薛寶玲等探討了不同月齡烏珠穆沁羊MyHC基因與脂肪及共軛亞油酸含量的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)烏珠穆沁羊MyHCⅠ基因與MyHCⅡa基因的表達量與脂肪中共軛亞油酸總含量的變化相對一致[17]。

盡管圍繞羊脂肪中的CLA已經(jīng)開展了很多研究[18-20]，但是如何提取利用羊脂肪中的CLA還沒有相關(guān)報道。本研究對比了不同提取溶劑、不同提取時間、不同提取溫度等對羊尾油脂的提取效果，重點研究了短程分子蒸餾技術(shù)提取油脂中共軛亞油酸的效果并對最佳提取工藝條件進行優(yōu)化，建立了羊尾脂中共軛亞油酸的高效提取技術(shù)。研究和開發(fā)羊尾脂高值化利用技術(shù)，可顯著提升羊尾脂經(jīng)濟價值，同時減少環(huán)境污染，這對于增加農(nóng)牧民收入，發(fā)展綠色畜牧業(yè)，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革和鄉(xiāng)村振興具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

從寧夏回族自治區(qū)鹽池縣采集灘羊屠宰后的新鮮羊尾樣品，編號后迅速放入冷藏保溫箱低溫冷藏保存，6 h內(nèi)放到實驗室-20℃冰箱冷凍保存。

1.1.2 試劑與儀器

無水Na2SO4（分析純）、正己烷（色譜純）、異丙醇（分析純）、NaOH（分析純）、CH3OH（分析純）、氯乙酰（分析純）、無水CH3OH（分析純）、石油醚（30℃～60℃，分析純）、正己烷（分析純）、環(huán)己烷（分析純）、無水乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；共軛亞油酸標準品：美國Sigma公司。

BSA124S-CW電子天平：德國Sartorius公司；MJWBL1022S破壁料理機：美的集團有限公司；MVS-1渦旋混合器：北京金北徳工貿(mào)有限公司；SC-5A水浴鍋：寧波新芝科技有限公司；Agilent HP-88色譜柱、7890B Agilent氣相色譜儀：美國Agilent公司；3K-15高速冷凍離心機：美國Sigma公司；KDL-5短程分子蒸餾儀（蒸發(fā)面積5 dm2）：德國UIC公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液制備

氫氧化鈉甲醇溶液：稱取2.0g氫氧化鈉溶于100mL無水甲醇中，混合均勻，其濃度為20 g/L，現(xiàn)用現(xiàn)配；200 mL/L鹽酸甲醇溶液：取10 mL氯乙酰[CH3COCl]緩慢注入盛有100 mL無水甲醇的250 mL錐形瓶中，混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；硫酸鈉溶液：稱取6.67 g無水硫酸鈉溶于100 mL水中，其濃度為66.7 g/L；異丙醇正己烷混合液：將異丙醇和正己烷（2∶3，體積比）混合均勻；共軛亞油酸（CLA）標準溶液：稱取c9，t11共軛亞油酸甲酯10.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，正己烷溶液溶解并定容至刻度，終濃度為95.2 μg/mL。

1.2.2 試樣處理

將樣品切成約1 cm3的方塊，浸入液氮中進行速凍，待肉塊變?yōu)榘咨湃肫票诹侠頇C中進行粉碎直至變?yōu)槟睢７Q取5 g～10 g，準確至0.01 g，置于蒸發(fā)皿中，蒸出水分，取出裝入濾紙筒內(nèi)。

1.2.3 不同有機溶劑抽提脂肪效率比較

將濾紙筒放入索氏抽提的抽提筒內(nèi)，連接已干燥至恒重的接收瓶，分別由抽提器冷凝管上端加入無水乙醇、環(huán)己烷、正己烷、石油醚至容器容積2/3處（70 mL），于加熱套加熱，使無水乙醇、環(huán)己烷、正己烷、石油醚不斷回流抽提（6次/h～8次/h），一般抽提 6 h～10 h。提取結(jié)束時，用磨砂玻璃棒接取1滴提取液，磨砂玻璃棒上無油斑表明提取完畢[21-22]。

取下接收瓶，回收無水乙醇、環(huán)己烷、正己烷、石油醚，加入適量無水硫酸鈉脫水后，在連有真空泵的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中以40℃水浴溫度進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得到粗脂肪，并重復步驟至恒重。

試樣中脂肪的含量按下式計算：

式中：X為試樣中脂肪的含量，%；m1為恒重后連接接收瓶和脂肪的含量，g；m0為接收瓶的質(zhì)量，g；m2為試樣的質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗

以石油醚為提取溶劑，在60℃的溫度、料液比為1 ∶30（g/mL）的條件下，比較不同提取時間（6、7、8、9、10 h）對粗脂肪提取率的影響；以石油醚為提取溶劑，在提取時間為6 h、料液比為1∶30（g/mL）的條件下，比較不同提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）對粗脂肪提取率的影響；以石油醚為提取溶劑，在提取溫度為60℃，提取時間為6 h的條件下，比較不同料液比[1∶20、1∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）]對粗脂肪提取率的影響。

1.2.5 響應面試驗

分別選取抽提時間、溫度、料液比，設(shè)計三因素三水平響應面試驗，見表1，通過檢測脂肪提取率衡量試驗效果。

表1 響應面試驗的因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface test

1.2.6 短程分子蒸餾提取CLA

將抽提的羊尾脂肪于60℃水浴恒溫至完全融化，利用短程分子蒸餾儀進行分子蒸餾，蒸餾溫度分別設(shè)定為 250、270、290、300、305、310、315、320、325、330、335 ℃。進料溫度為40℃；操作真空度為1 mbar，刮板轉(zhuǎn)速為378 r/min。同時在每一次變化蒸餾的溫度，實施短程分子蒸餾前，用無水乙醇、石油醚把設(shè)備洗凈。使設(shè)備內(nèi)壁的乙醇與石油醚自然揮發(fā)，以免污染分餾的產(chǎn)物。將所得的分子蒸餾輕相和重相分餾物分裝，冷卻后稱重，計算輕相分餾物得率，于4℃條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

采用具有100%聚甲基硅氧烷涂層的毛細管柱結(jié)合二階程序升溫分離檢測[23-24]。升溫程序：120℃維持10 min，然后以3.2℃/min升溫至230℃，維持35 min。進樣口溫度：250℃。檢測器溫度：300℃。載氣：氮氣。柱前壓：190 kPa。分流比：1∶50。氫氣和空氣流速分別為30 mL/min和400 mL/min。

取共軛亞油酸（CLA）標準溶液及測試液各2 μL進樣，以色譜峰面積定量。

1.2.8 CLA含量計算

試樣中CLA含量以質(zhì)量分數(shù)Xi計，數(shù)值單位以mg/g表示，按下式計算：

式中：Ai為試液中第i種CLA峰面積；Ais為標準溶液中第i種CLA峰面積；Ci為標準溶液中第i種CLA濃度，μg/mL；m為試樣質(zhì)量，g；V為試樣體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶劑對脂肪提取率的影響

索氏抽提是利用溶劑回流及虹吸原理，使固體物質(zhì)連續(xù)不斷地被純?nèi)軇┹腿?，重復回流提取，增加了油脂與純?nèi)軇┑慕佑|機會，大大減少了油脂的提取時間[25]，不同溶劑對脂肪提取率的結(jié)果見表2。

表2 不同溶劑對脂肪提取率的影響Table 2 Effect of different solvents on the extraction rate of fat

不同溶劑對灘羊尾中脂肪的提取率存在顯著性差異（p＜0.05），其中石油醚對脂肪的提取率效果最好，為91.66%，正己烷與異丙醇相差不大，無水乙醇提取率最低為59.15%，因此選用石油醚為提取脂肪的溶劑。

2.2 對比不同提取溫度、時間和料液比對脂肪提取率的影響

以石油醚為提取溶劑，分別比較不同溫度、不同提取時間、不同料液比對脂肪提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

綜上所述，我國的經(jīng)濟得到了飛快的發(fā)展，城市化建設(shè)進程不斷加快，產(chǎn)生了大量的交通問題，如交通排放物對環(huán)境的污染、交通擁堵以及交通事故頻繁發(fā)生等問題，使人們越來越追求交通的順暢性和環(huán)保性。近年來，物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展為解決交通問題帶來了很多好的技術(shù)支持，給智慧交通的發(fā)展帶來了很好的動力和新的發(fā)展方向，從而便于交通系統(tǒng)的智能化發(fā)展，為交通服務(wù)和決策提供數(shù)據(jù)方面的支持，這樣不僅可以合理地使用交通設(shè)施，還能改善交通擁堵的情況，從而為人們的生活提供順暢便利的交通環(huán)境。

脂肪提取率隨著提取溫度的升高和提取時間的延長，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在60℃和8 h時提取率達到最高，而料液比對脂肪提取率的影響并不明顯。

2.3 抽提參數(shù)的響應面優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對提取時間、溫度、料液比進行響應面優(yōu)化試驗，研究采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計，選取時間、溫度、料液比為自變量，以脂肪提取率為響應值設(shè)計三因素三水平響應面試驗，結(jié)果見表3。

圖1 不同溫度、時間和料液比對脂肪提取率的影響Fig.1 Effect of different temperature，time and material solvent ratio on fat extraction rate

表3 響應面設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 3 Design proposal and experiment result of response surface

利用Design Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行方差分析，將試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到脂肪提取率（R）對時間（A）、溫度（B）、料液比（C）的回歸方程為：

R=89.62-0.19A+0.98B+0.15C-0.032AB-0.036AC-0.92BC-2.94A2-2.87B2-0.72C2

圖2為時間、溫度和料液比交互作用對脂肪提取率的響應曲面圖。由圖2可以看出，時間、溫度、料液比這3個變量，在兩兩交互時，保持其中一個變量不變，隨著另外兩個變量的增加，脂肪提取率呈現(xiàn)上升的趨勢，當達到一定值時又呈現(xiàn)出下降趨勢，提取時間和提取溫度對脂肪提取率影響較大。

圖2 脂肪提取率響應面圖Fig.2 Fat extraction rate response surface

應用響應面優(yōu)化分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優(yōu)響應結(jié)果見表4。

表4 響應面優(yōu)化結(jié)果Table 4 Results of response surface optimization

為檢驗在響應面優(yōu)化出的條件下所得結(jié)果的可靠性，按照提取溫度62℃、提取時間8 h以及料液比為1∶30（g/mL）進行驗證試驗，得到的脂肪提取率為89.462%，響應面優(yōu)化的預測值與試驗值之間的擬合性良好，從而證實了模型的有效性。

2.4 短程分子蒸餾技術(shù)提取羊尾油脂中共軛亞油酸工藝

從上述過程中得到了精煉的羊尾油脂，進一步利用短程分子蒸餾技術(shù)研究了羊尾油脂中共軛亞油酸最佳的蒸餾溫度，并建立羊尾油脂中提取共軛亞油酸的短程分子蒸餾技術(shù)工藝。在短程分子蒸餾過程中，蒸餾溫度是最重要的參數(shù)之一[26]，本研究發(fā)現(xiàn)當蒸餾的溫度小于250℃時，輕相分餾物所占百分比極少，說明羊尾脂肪里的成分未有效分離；從250℃開始，羊尾脂肪中較小的組分先被分離，但產(chǎn)率小，輕相分餾物產(chǎn)率只有8.75%，逐漸升溫，當溫度升高至290℃時，輕相分餾物產(chǎn)率顯著上升。不同蒸餾條件所得到的輕相和重相分餾物如表5所示。

表5 不同蒸餾條件對分餾物的影響Table 5 Effect of different distillation conditions on fractions

2.5 分餾物中CLA含量的測定

分別配制CLA標準溶液至濃度為219.78、109.89、54.95、10.99、5.49 μg/mL。以含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，如圖3所示。得到CLA線性回歸方程 y=0.227 742 7x-0.349 376 1，R2=0.999 39。

不同蒸餾溫度下CLA的含量見圖4。

圖3 濃度與峰面積的標準曲線Fig.3 Standard curve of concentration and peak area

圖4 不同蒸餾溫度下CLA的含量Fig.4 CLA content at different distillation temperatures

對羊尾脂肪及其在不同蒸餾溫度下的分餾物進行共軛亞油酸含量的定量分析，發(fā)現(xiàn)羊尾脂肪中共軛亞油酸含量隨蒸餾溫度呈正相關(guān)關(guān)系，如圖4所示，蒸餾溫度由250℃至335℃變化的過程中，CLA含量從250℃的2.13 mg/g，提升到320℃的19.35 mg/g，這是由于共軛亞油酸是中長鏈脂肪酸，隨著溫度升高，首先蒸餾出短鏈脂肪酸，之后蒸餾出長鏈脂肪酸，在315℃時，十八碳脂肪酸開始分離出，導致在315℃時，CLA的含量大幅度上升，達到18.65 mg/g，繼續(xù)升高溫度，長鏈脂肪酸開始分離，對十八碳脂肪酸影響不大，故CLA在輕相中的相對含量開始下降。因此從羊尾油脂中分離CLA的最佳蒸餾溫度是320℃，在此條件下，CLA的含量為19.35 mg/g。

3 結(jié)論

通過對比正己烷、石油醚、環(huán)己烷、異丙醇、無水乙醇對于油脂的提取效果，發(fā)現(xiàn)石油醚提取油脂效果要優(yōu)于正己烷、環(huán)己烷和無水乙醇，通過響應面法確定了最佳油脂提取條件為提取溫度62℃、提取時間8 h以及料液比為1∶30（g/mL），在該條件下，油脂提取率可達到89.46%。在上述研究基礎(chǔ)上，根據(jù)不同脂肪酸的平均自由程不同，利用短程分子蒸餾技術(shù)對提取的油脂進行共軛亞油酸的蒸餾工藝研究，確定了當蒸餾溫度為320℃，真空度為1 mbar時，可有效地從羊尾油脂中蒸餾出共軛亞油酸，此時蒸餾輕相中共軛亞油酸的含量為19.35 mg/g，比傳統(tǒng)分餾方法產(chǎn)率高59.58%。研究和開發(fā)羊尾脂高值化利用技術(shù)，可顯著提升其經(jīng)濟價值，減少環(huán)境污染，這對于增加牧民收入，發(fā)展綠色畜牧業(yè)，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革和鄉(xiāng)村振興具有重要意義。