邢磊，郭園藝，汪自慶*，麻鵬達(dá)*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西 楊陵712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊陵71200）

羊草（Leymus chinensis）是亞洲中部草原的建群種牧草，屬多年旱生叢生禾草［1］，在實(shí)際生產(chǎn)常見東北、吉生1-4 號、農(nóng)牧1 號羊草等品種。羊草根系穿透能力強(qiáng)，具有良好的適應(yīng)脅迫環(huán)境的抗逆特性。羊草根系穿透能力強(qiáng)，內(nèi)部還有相關(guān)的植物形態(tài)適應(yīng)鹽堿脅迫，因此羊草具有良好的抗逆性，這也是羊草能在內(nèi)蒙古、東北等高鹽高堿的環(huán)境中生長的主要原因［2］。已有研究表明，在非生物脅迫條件下羊草基因能做出相應(yīng)反應(yīng)來適應(yīng)逆境，尤其是一些酶類基因，當(dāng)羊草受到脅迫時(shí)，這些酶基因可以調(diào)控羊草產(chǎn)生相關(guān)的活性物質(zhì)進(jìn)行防御反應(yīng)［3］。目前，由于草場過度放牧以及不合理的利用等人為因素，各草場草地環(huán)境惡化，草種的質(zhì)量迅速下降，生態(tài)環(huán)境遭到破壞，因此，高質(zhì)量、抗逆性羊草研究迫在眉睫。而近年來關(guān)于羊草能夠適應(yīng)脅迫環(huán)境的抗逆基因報(bào)道較少，羊草對鹽堿的耐受性及其適應(yīng)不同逆境的分子機(jī)制的研究尚不明確［4］。因此，尋找羊草抗逆的相關(guān)基因，進(jìn)一步培育抗旱耐鹽堿的轉(zhuǎn)基因作物，對我國草業(yè)發(fā)展具有重大意義。

谷 胱 甘 肽S 轉(zhuǎn) 移 酶（Glutathione-S-transfer?ase，GST）是動植物及微生物體內(nèi)參與生物轉(zhuǎn)化代謝的重要酶類。所有真核物種都具有多種與細(xì)胞質(zhì)膜相結(jié)合的GST 同工酶。目前，關(guān)于動物中GST 的研究多集中于能否有效清除體內(nèi)有毒有害物質(zhì)，以保護(hù)動物細(xì)胞免受氧化侵害，而植物中GST 的研究集中于能否有效解除除草劑和殺蟲劑等的毒性，以及植物GST 的克隆和功能分析。根據(jù)核酸序列、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)以及底物等性質(zhì)的不同，GST 可以分為10 個(gè)亞類，即：Phi（F）、Tau（U）、Theta（T）、Zeta（Z）、Lambda（L）、DHAR、TCHQD、EFIG、Iota 和Hemerythrin。其中，植物所 特 有 的 是Phi、Tau、L ambda 和DHAR 類［5，6］。GST 蛋白通常由同源或異源二聚體構(gòu)成，構(gòu)成二聚體的每一個(gè)亞基都包含N 端和C 端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，用于連接結(jié)構(gòu)域的為5～10 個(gè)氨基酸構(gòu)成的可變區(qū)。其中N 端包含相對保守的GSH 特異結(jié)合位點(diǎn)（G 位點(diǎn)），相對比較保守。而C 端包含結(jié)合疏水底物的位點(diǎn)（H 位點(diǎn)），該位點(diǎn)可變性較大。多項(xiàng)研究表明，GST 基因在植物的生長發(fā)育、生命進(jìn)程及抗逆中起著非常重要的作用，如：參與植物的初、次 級 代 謝 及 非 生 物 脅 迫、細(xì) 胞 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 等［5～9］。GST 蛋白能夠跨膜運(yùn)輸，將植物自身次級代謝物運(yùn)輸?shù)街付ú课唬糜诘挚雇獠棵{迫［10］。在植物處于各種脅迫環(huán)境中時(shí)，如遭遇病原菌誘導(dǎo)、除草劑脅迫、鹽脅迫和重金屬脅迫等，GST 蛋白的兩個(gè)亞基開始發(fā)揮作用，通過催化還原型谷胱甘肽的巰基與外源有毒有害物質(zhì)的親電或親脂基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合，形成水溶性的復(fù)合物，并將復(fù)合物排到細(xì)胞外，使用這種解毒方式來保護(hù)植物細(xì)胞免受環(huán)境中的生物及非生物脅迫傷害［11，12］。

基于目前對于羊草GST 基因抗逆的研究報(bào)道較少，且我國草業(yè)發(fā)展的需要，本研究以羊草GST基因的電子克隆序列作為參考，使用RT-PCR 技術(shù)和RACE 技術(shù)從羊草中克隆該基因，并采用生物信息學(xué)手段對其進(jìn)行相關(guān)分析，進(jìn)一步了解羊草GST 基因的生物學(xué)功能以及分析羊草抗逆分子機(jī)制，為我國轉(zhuǎn)基因作物研究提供良好的基因資源［3］。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取大小均一，顆粒飽滿的羊草種子，將其置于盛滿蛭石的花盆中，于人工氣候培養(yǎng)箱，25°C 恒溫培養(yǎng)［13］，箱內(nèi)光強(qiáng)度為11 000～13 000 lx，光照周期為16 h·d-1，待羊草長出新苗后，每天堅(jiān)持澆1次0.5 倍霍格蘭營養(yǎng)液，待其長出4 葉停止培養(yǎng)，-80℃下保存，以備提取總RNA。

1.2 羊草總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄

羊草總RNA 的提取按照RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）操作進(jìn)行，采用軟件Nanodrop 2000 對提取的總RNA 的濃度及純度進(jìn)行檢測，并采用1% 的瓊脂糖凝膠電泳對總RNA 的純度進(jìn)一步檢測。

總RNA 的反轉(zhuǎn)錄采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司，北京）進(jìn)行，其操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 RACE 和 全 長cDNA 克 隆

通過Genbank 檢索，獲得羊草GST 蛋白的EST 序 列（登 錄 號：CD808535）。 與NCBI BLASTX 比對發(fā)現(xiàn)，其基因序列為羊草GST 基因的5'端?；贓ST 序列，采用Primer Primer5.0 軟件分別設(shè)計(jì)GST 基因的3'RACE 特異性引物。根據(jù)Clontech 公 司 的RACE 試 劑 盒（SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit）說明書進(jìn)行后續(xù)PCR 反應(yīng)。使用DNAMAN 拼接EST 序列及通過RACE 得到目的基因5’端序列，由此得到羊草GST 蛋白的全長cDNA 序列。

1.4 序列拼接及基因閱讀框分析

利用檢索工具NCBI 中的BLAST 將羊草GST 蛋白5' RACE 的結(jié)果和原有EST 序列進(jìn)行拼 接，并 采 用NCBI“ORF finder”在 線 程 序（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html）對所獲得GST 基因序列的開放閱讀框進(jìn)行分析。

1.5 蛋白理化性質(zhì)分析

利 用 ProtParam、Protscale、Netphos3.1 和NetOGlyc3.1 軟件對羊草GST 蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、親疏水性、磷酸化及糖基化位點(diǎn)預(yù)測分析，用SingalP4.1、TMHMM 和ScanProsite 軟 件 對 羊 草GST 蛋白進(jìn)行信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，用Psort Prediction 在線軟件對羊草GST 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，使用COILS、PSIPRED、SOP?MA、Phyre2 和PyMol 軟件對羊草GST 蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用NCBI 中的BLASTN，將羊草GST 基因與各種植物GST 基因進(jìn)行序列比對，分析其序列的同源性。采用DNAMAN6.0 進(jìn)行多序列比對，MEGA5.0 構(gòu)建各植物GST 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，設(shè)置重復(fù)1000 次，其他均為默認(rèn)設(shè)置。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊草GST 基因全長cDNA 的獲得

通過5'RACE，獲得長372 bp 的5'末端TA 克隆產(chǎn)物。將5'RACE 擴(kuò)增序列與羊草GST 基因EST 序列進(jìn)行拼接，得到羊草GST 基因全長序列，經(jīng)測序長為833 bp。采用“ORF finder”分析得該羊草GST 蛋白具有654 bp 開放讀碼框，81 bp 的5'UTR和98 bp的3'UTR非編碼區(qū)，得到的羊草GST基因編碼具有217個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（圖1）。

圖1 羊草GST 的全長cDNA 序列以及編碼的氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of L.chinensis GST protein

2.2 羊草GST蛋白生物信息學(xué)分析

2.2.1 羊草GST 基因（LcGST）編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

利用ProtParam 在線分析工具分析LcGST 基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，羊草GST 蛋白由碳、氫、氧、氮和硫5 種元素組成，其分子式為C1141H1763N297O306S8，相對分子質(zhì)量為24.78 kDa，理論等電點(diǎn)為5.81，其值小于7，表明羊草LcGST 蛋白是一個(gè)弱酸性蛋白質(zhì)（表1）。從氨基酸組成特點(diǎn)來看，GST 蛋白包含20 種常見氨基酸（表2），其中含量最高的為Leu（10.55%），其次為Glu（10.09%）和Val（10.09%），含量最低的為Asn（0.92%）和Thr（0.92%）。羊草GST 蛋白其他理化特性如表1 所示，其所帶的電荷情況為負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為32，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為28，脂溶性系數(shù)（AI）數(shù)值為90.74，不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）數(shù)值為33.86。羊草GST 蛋白的總平均親水性（Grand average of hy?dropathicity，GRAVY）為-0.161，表明羊草GST蛋白應(yīng)該屬于親水性蛋白。根據(jù)Protscale 分析得到的親/疏水信號圖（圖2）可知，GST 蛋白C 端含有疏水頭部，N 端為親水頭部，中間氨基酸靠近C端部分表現(xiàn)為親水性，靠近N 端部分表現(xiàn)為疏水性，其中以A29A30殘基親水性最強(qiáng)（-2.544），以A155殘基疏水性最強(qiáng)（1.689）。整體看來，羊草GST 蛋白的親/疏水信號圖中，峰值分布在-0.5 以下的信號明顯多于0.5 以上的信號，這個(gè)結(jié)果也進(jìn)一步證明羊草GST 蛋白為親水性蛋白。

表1 GST 基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析Table 1 Physico?chemical properties of GST deduced proteins

圖2 羊草GST 蛋白的疏水性/親水性預(yù)測Fig.2 Leymus chinensis GST protein Hydropathicity prediction

2.2.2 LcGST 基因編碼蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)預(yù)測

利用NetPhos3.1 分析，得到LcGST 蛋白存在3 種磷酸化位點(diǎn)，分別為1 個(gè)絲氨酸（serine）位點(diǎn)、1個(gè)蘇氨酸（threonine）位點(diǎn)和2 個(gè)酪氨酸（tyrosine）位點(diǎn)（系統(tǒng)預(yù)設(shè)的閾值之上）（圖3）。根據(jù)NetO?Glyc3.1 進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析，羊草LcGST 蛋白不存在潛在的糖基化修飾位點(diǎn)。

圖3 羊草GST 蛋白的磷酸化修飾預(yù)測Fig.3 Phosphorylation prediction of L.chinens is GST protein

2.2.3 LcGST 基因編碼蛋白質(zhì)的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位預(yù)測

采用SignalP 4. 1 對羊草LcGST 蛋白的信號肽序列進(jìn)行分析，結(jié)果（表明羊草LcGST 蛋白未發(fā)現(xiàn)有信號肽，并且不存在剪切位點(diǎn)。由此推測，羊草LcGST 蛋白為非分泌型蛋白，可能不進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，直接在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中起作用圖4）。同時(shí)使用軟件TMHMM 2. 0 對羊草LcGST 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，羊草LcGST 蛋白位于膜外，并不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，也并未發(fā)現(xiàn)膜內(nèi)的氨基酸序列，非膜蛋白（圖5）。采用Psort Prediction 對羊草LcGST 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示，羊草LcGST 蛋白通常定位于含有氧化酶體及過氧化物酶體的微體（Microbody），生命活動的主要場所細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm），含有多種氧化酶的線粒體基質(zhì)空間（Mitochondrial matrix space）以及葉綠體類囊體膜（Chloroplast thylakoid membrane）中，這也側(cè)面表明羊草GST 蛋白極可能參與生物體脫毒（表2）。將信號肽預(yù)測結(jié)果和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果及亞細(xì)胞定位綜合來看，可以推測出羊草LcGST 蛋白在游離核糖體上合成蛋白多肽，然后由引導(dǎo)肽將蛋白質(zhì)導(dǎo)向靶位點(diǎn)，之后大部分在微體和細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，而有少量在線粒體基質(zhì)及葉綠體類囊體上發(fā)揮作用。

圖4 羊草GST 蛋白的信號肽預(yù)測Fig.4 Prediction ofthe signal peptide for L.chinensis GST protein

圖5 羊草GST 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 Prediction of the transmembrane domains in L.chinens is GST protein

表2 基于PSPORT 預(yù)測羊草GST 蛋白的亞細(xì)胞定位Table 2 Subcellular location of GST based on PSPORT

2.2.4 LcGST 基因編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

采用NCBI 在線分析工具CD Search 和在線軟件InterPro 中檢索的EBI 數(shù)據(jù)庫分析LcGST 蛋白的功能位點(diǎn)和保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示LcGST 蛋白含有2 個(gè)典型的GST 保守結(jié)構(gòu)域，其中類硫氧還原蛋白超家族的GST-N-Tau 結(jié)構(gòu)域存在于蛋白N 端，在此結(jié)構(gòu)域中含有較為保守的谷胱甘肽特異結(jié)合的G 位點(diǎn)（圖6，7）。而LcGST 蛋白的C端為GST-C 超級家族的GST-C-Tau 結(jié)構(gòu)域，用于結(jié)合疏水底物的H 位點(diǎn)就存在于該結(jié)構(gòu)域中，且該位點(diǎn)可變性較大。分析結(jié)果說明LcGST 蛋白屬于Tau 類GST 蛋白。

圖6 羊草GST 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.6 Prediction of conserved domains in L.chinensis GST protein

2.2.5 LcGST 基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Expasy 的Coils 對羊草LcGST 蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)羊草該蛋白沒有明顯的卷曲螺旋。再使用PSIPRED 和SOPMA 對羊草LcGST 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，分析結(jié)果（圖8）顯示，LcGST 蛋白中氨基酸殘基組成以α-螺旋為主（58.99%），伴有少量的β-折疊（9.68%）。

2.2.6 LcGST 基因編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Phyre2 同源建模軟件模擬LcGST 蛋白的三維結(jié)構(gòu)。預(yù)測得到與LcGST 蛋白相似度最高（100%）的模板為c4agsA，根據(jù)此模板對Lc?GST 蛋白的209 個(gè)氨基酸進(jìn)行同源建模（圖9），得到的模型覆蓋度為96%。利用PyMOL 三級結(jié)構(gòu)顯示軟件分析LcGST 蛋白的同源建模結(jié)果，并以二級結(jié)構(gòu)標(biāo)記顏色。

圖7 LcGST 蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測Fig.7 Prediction of functional sitesin LcGST protein

圖8 LcGST 蛋白二級結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.8 Prediction of secondary structure in LcGST protein

圖9 羊草GST 蛋白的同源模建空間結(jié)構(gòu)Fig.9 The model of steric structure of L.chinensis GST protein

2.2.7 LcGST 基因編碼蛋白質(zhì)的進(jìn)化分析

以羊草GST 蛋白序列為探針，通過NCBI 中的BlastP 進(jìn)行比對尋找，下載與探針蛋白相似性較高的蛋白序列，利用軟件DNAMAN 將羊草Lc?GST 與其它植物GST 蛋白序列進(jìn)行多序列比對（圖10），得到的GST 蛋白序列比對的一致性只有60.25%，保守結(jié)構(gòu)域較短，且其上氨基酸相似度較低。有其他研究表明［10］，不同植物不同類型的GST 序列之間的差異還是比較大的。雖然不同GST 蛋白N 端和C 端有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的保守性相對較高，但不同類型的GST 氨基酸的序列的同源性很低，本研究的序列比對結(jié)果符合這一結(jié)論。利用軟件MEGA6.0（鄰近法）構(gòu)建LcGST 蛋白與其它幾種植物GST 蛋白的NJ 進(jìn)化樹（圖11），結(jié)果表明，在進(jìn)化關(guān)系中，羊草GST 蛋白與二穗短柄草最近，次之為日本稻和小米，而與菠蘿和番茄進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

植物GSTs 擁有復(fù)雜的家族成員，并且功能各異，參與植物的多種生命歷程和生長發(fā)育調(diào)控［5-6］。本研究的實(shí)驗(yàn)材料為優(yōu)質(zhì)的具有強(qiáng)抗寒抗旱耐鹽堿的禾本科牧草—羊草，通過已知的EST 序列，采用RT-PCR 和RACE 技術(shù)等分子生物學(xué)手段對基因的同源區(qū)和全序列進(jìn)行克隆，成功克隆出Lc?GST。并采用多種生物信息學(xué)軟件對羊草GST 基因序列及蛋白序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，羊草的GST 蛋白為穩(wěn)定的217 個(gè)氨基酸編碼的弱酸性親水蛋白，含有4 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，不含糖基化位點(diǎn)。不含有信號肽結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域，但擁有兩個(gè)典型的GST-C-Tau 和GST-N-Tau 保守結(jié)構(gòu)域，表明其屬于Tau 類GST 蛋白。羊草GST 蛋白亞細(xì)胞定位于微體，細(xì)胞質(zhì)，線粒體基質(zhì)空間和葉綠體類囊體，其二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)以α 螺旋為主，伴以少量β 折疊。進(jìn)化分析的結(jié)果則顯示羊草GST蛋白與二穗短柄草的親緣關(guān)系最近。

目前已發(fā)表的研究表明，胞質(zhì)中存在大量的可溶性GST［14，15］。模式生物擬南芥GST 的基因組分析表明，目前發(fā)現(xiàn)僅兩個(gè)phi 類和Lambda 類的GST 蛋白擁有一段定位序列，該序列能夠使GST蛋白定位于質(zhì)體和線粒體。除此之外的幾乎所有GST 蛋白都不包含這些能夠幫助自身定位的序列，基因組分析預(yù)測這些不包含定位序列的蛋白應(yīng)該存在于胞質(zhì)中［14］，并且少量的GST 蛋白也在細(xì)胞核或細(xì)胞外發(fā)生表達(dá)。本研究中的羊草Lc?GST 蛋白屬于Tau 類，與其他植物中的大多數(shù)GST 蛋白的亞細(xì)胞定位情況保持一致，雖有少部分定位于線粒體基質(zhì)空間，但也不具有該段定位序列。本研究磷酸化預(yù)測表明羊草GST 蛋白具有4 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為1 個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、1 個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和2 個(gè)酪氨酸位點(diǎn)，說明羊草GST 有重要的生物學(xué)作用，其更精確的結(jié)構(gòu)需要更先進(jìn)的技術(shù)手段進(jìn)行確認(rèn)，其抗逆分子機(jī)制及其他生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步生物驗(yàn)證和分析。

采用生物信息學(xué)手段對羊草GST 基因進(jìn)行分析的結(jié)果表明，該LcGST 蛋白具有保守GST 結(jié)構(gòu)域。而在植物體內(nèi)消耗的O2部分被轉(zhuǎn)化成溶解氧（ROS），ROS 的濃度高低決定了其對植物體是否有益。高濃度的ROS 累積會對植物細(xì)胞造成氧化損傷甚至死亡。因此，ROS 過度積累后的清除對細(xì)胞正常生長具有重要意義。有研究表明［16］，GST 作為一種重要的解毒酶，在植物面對逆境時(shí)，能夠通過ROS 的清除對細(xì)胞的損傷進(jìn)行修復(fù)。同時(shí)擬南芥GST 中有的參與類黃酮代謝［17］，有的參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［17］，還有的對植物逆境，病原物侵染和植物激素有響應(yīng)［19］，有研究表明［20］，將核桃Tau 類GST 基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，對釀酒酵母施以鹽及低溫脅迫，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因酵母與對照相比展現(xiàn)出更強(qiáng)的生命力和存活率；毛白楊［21］，水稻［22］，大豆［23］等的GST 蛋白都有一定的抗逆活性。羊草GST 基因在植物體內(nèi)的解毒作用是否通過消除ROS 來實(shí)現(xiàn)，還需要進(jìn)一步生物驗(yàn)證。

本研究結(jié)果為羊草GST 基因的生物學(xué)功能的了解以及羊草抗逆分子機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也為GST 蛋白功能的進(jìn)一步研究提供了一定的數(shù)據(jù)支撐。羊草GST 基因是否具有提高羊草抗逆脅迫的能力，我們還需做之后的表達(dá)分析及轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)來進(jìn)一步佐證。