趙俸涌 郭忠慧 李勤 楊啟修 朱自嚴

破壞微生物的生物學活性稱之為滅活，此外滅活在血漿制品制作流程中還指破壞血清中補體的活性，滅活方法均對微生物可激發(fā)人體免疫應答的保護性抗原產生較小影響[1]。通常對于含有致病病毒的體液及血液等液體樣本（如含有COVID-19的體液或血液樣本），滅活方法通常采用56℃水浴30分鐘的方法進行[2]。

輸血前患者需要進行血型鑒定與配血以降低輸血免疫風險，紅細胞血型血清學鑒定依賴抗體對紅細胞表面抗原特殊空間結構的識別，物理、化學及生物處理都會對紅細胞抗原空間結構造成破壞。已有研究表明，保存損傷對血型抗原存在一定影響，其原因主要是膜骨架穩(wěn)定性下降后，膜蛋白空間結構發(fā)生了變化[3,4]。在保存老化試驗中，通常以37～42℃水浴作為老化模擬[5]。新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）流行以來，血液樣本需經水浴滅活處理后方可進行后續(xù)試驗，而滅活中56℃水浴條件較37℃對紅細胞結構及紅細胞表面膜蛋白結構影響更大。而滅活程序對紅細胞血型抗原的影響及進一步對血清學檢測實驗靈敏度的影響還未見相關報道。因此，本研究通過對血液樣本滅活后進行抗原檢測，以評估滅活程序對紅細胞血型抗原檢測的影響。

材料與方法

1 樣本制備 血樣來自本研究室人員志愿提供，共5例RhD、Fya陽性全血（AB型3例，B型1例，O型1例），全血EDTA?2K抗凝后，將每例樣本分為兩組、每組1 mL分裝，模擬滅活組置于56℃水浴，滅活30 min。對照（control）組置于室溫30 min。

2 試劑與儀器

2.1 主要試劑：抗-A單克隆抗體（BRIC131，BRIC）,抗-B單克隆抗體（ES-4,BRIC）、抗-D單克隆抗體（RUM-1，BRIC）BRIC，抗-Fya單克隆抗體（P3TIM, Sanquin），微柱凝膠卡[抗人球（Bio-Rad）：50531.38.18 鹽水（Bio-Rad）：50520 59 08]。

2.2 主要儀器：孵育儀（Incubator 37 SI），凝膠卡離心機（Centrifuge 12 S Ⅱ）。

3 抗體滴定 抗-A、抗-B、抗-D、抗-Fya試劑滴定至凝集強度保持約4+的臨界點（各抗體滴定度見表1）。

表1 血型檢測試劑稀釋表

4 A、B、RhD、Fya抗原血清學檢測 將上述待測紅細胞樣本使用PBS在血清學離心機中3次洗滌后，配制1%紅細胞懸液待用。采用標定后的抗-A、抗-B、抗-D對上述樣本進行凝膠卡法檢測。將抗體繼續(xù)用2倍稀釋法制備梯度抗體，并依據(jù)說明書進行凝膠柱法檢測，記錄凝集強度結果，凝集打分依據(jù)見圖1。

圖1 微柱凝膠卡檢測評分表

結 果

1 水浴滅活對樣本外觀及結果判斷的影響 水浴滅活后，血液樣本發(fā)生溶血，血漿顏色發(fā)生明顯變化，導致無法對溶血性抗體進行判讀，結果見圖2。

2 細胞形態(tài) 通過顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，滅活后紅細胞形態(tài)發(fā)生形變、皺縮、出棘等現(xiàn)象（圖3）。

3 水浴滅活對血清學檢測血型抗原的影響 通過標定抗體對各抗原進行凝膠柱法檢測后發(fā)現(xiàn)，A、B抗原在各個稀釋度中均未出現(xiàn)具有統(tǒng)計學意義的差異，見圖4A、圖4B；而RhD抗原在各稀釋度檢測時均出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（8倍稀釋時：P＜0.05；16～256倍稀釋時：P＜0.01），見圖4C，F(xiàn)ya抗原在各稀釋度檢測時均出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。打分結果統(tǒng)計見圖4。

圖2 56℃滅活對血液樣本外觀影響（n=5）

圖3 滅活前后細胞形態(tài)學變化（40×明場）

圖4 不同稀釋度對滅活處理后細胞抗原檢測變化趨勢圖

討 論

哺乳動物成熟紅細胞不具有細胞核，其發(fā)揮生理功能主要依靠膜蛋白。同時眾多血型抗原的生物學基礎也是紅細胞膜蛋白或其糖基化修飾物。紅細胞膜結構的變化及其導致的紅細胞輸注效果的改變，已在紅細胞體外保存試驗中被證實。

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）發(fā)生以來，全球感染數(shù)量不斷上升。有患者需要輸血治療時，需進行血型鑒定與配血，為保護工作人員安全，血樣滅活是必需流程。目前對于體液等液體類樣本采用56℃水浴30分鐘的方法。在相關研究中，37℃～42℃水浴作為紅細胞老化的經典方法，已被廣泛采用，其對紅細胞膜結構的破壞亦被細胞學試驗所證實， 因此56℃水浴滅活勢必對紅細胞膜結構有破壞作用。

在滅活后，血樣出現(xiàn)明顯溶血現(xiàn)象，使得分離后的血漿呈現(xiàn)暗紅色，一方面會導致對結果判讀產生干擾，另一方面也會導致造成溶血現(xiàn)象的抗體無法被檢出[6，7]，干擾抗篩試驗。

在紅細胞抗原檢測方面，本研究選擇了對臨床輸血最為關鍵的ABO血型系統(tǒng)A、B抗原（糖鏈抗原），Rh血型系統(tǒng)RhD抗原（多穿膜蛋白抗原）作為主要研究對象，同時還對被證實為保存穩(wěn)定性最差的Duffy系統(tǒng)Fya抗原（糖基化蛋白）進行了檢測。通過本研究發(fā)現(xiàn)，在靈敏度較高的血清學試驗中，滅活程序將導致紅細胞抗原性下降，RhD抗原下降程度高于A、B抗原。這可能的原因是：首先，RhD抗原的抗原本質是蛋白質空間構象，因而抗體識別時對抗原空間結構要求較為苛刻，這一點在D變異型中亦得到證實[8-10]； A、B抗原的識別主要在于糖鏈基團的識別[11]，而對蛋白空間結構依賴較少，故并未發(fā)生如RhD般顯著變化。Duffy血型系統(tǒng)抗原被研究證實是保存期間最易減弱的抗原[11]，在本研究中，56℃滅活亦對Duffy血型系統(tǒng)Fya造成了較大破壞，這也同時說明加熱對整個紅細胞膜表面蛋白造成較大的破壞。

此外，在本實驗中還發(fā)現(xiàn)，在A、B抗原檢測中，滅活樣本出現(xiàn)凝集略微增強的現(xiàn)象（圖4A、圖4B），但并不具有統(tǒng)計學意義，我們推測其可能的原因是，如圖3所示滅活后，細胞形態(tài)及膜電位的改變造成細胞通過凝膠卡時的動力學因素改變，并且由于糖鏈熱穩(wěn)定性優(yōu)于蛋白質，故其并未出現(xiàn)RhD抗原檢測中的明顯凝集強度下降，卻表現(xiàn)出略微增強的試驗現(xiàn)象。

綜合本實驗結果說明，熱滅活對紅細胞血型抗原有一定的破壞作用，樣本溶血后，血漿樣本對抗篩試驗產生干擾，紅細胞膜蛋白空間結構被破壞，造成試劑對抗原檢測靈敏度下降，說明該滅活手段不利于血型鑒定及配血試驗的進行。

由于亞型或變異型造成弱抗原樣本較難獲得，本研究中并未使用弱抗原紅細胞進行實驗。從目前實驗結果分析，雖然56℃滅活程序對正常抗原表達的紅細胞抗原產生一定破壞作用， 但并未對紅細胞抗原的陰性/陽性結果判讀產生影響，但實驗中觀察到滅活過程使凝集強度明顯下降，故我們推測對弱表達的紅細胞血型抗原產生的影響應更大，可能會直接造成抗原無法檢出，影響實驗判讀。

此外，本研究觀察到56℃對紅細胞膜蛋白的破壞作用，理論上亦會對血漿中的抗體產生破壞作用，

雖然本研究并未對該內容進行深入研究，但提示在臨床樣本抗體檢測鑒定工作中，應對該問題進行考慮，

并進行留樣及相關實驗。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突