王 悅，劉曉燕，張海霞

(蘭州大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

血清是非常復(fù)雜的混合物，其中某些高豐度蛋白會對血清中小分子的檢測過程造成干擾[1-2].若能設(shè)計合成一種可以去除血清中高豐度蛋白的吸附劑，在樣品前處理過程將蛋白的干擾去除，對小分子目標(biāo)物的檢測來說，是一種有效方法.

目前常用去除高豐度蛋白的方法包括基于親和技術(shù)的去除方法，如利用染料[3]、免疫[4]、多肽[5]親和色譜法以及其它親和層析技術(shù)[6]、沉淀法和超濾離心法[7]、金磁微粒去除法[8-9]以及等電捕獲法及制備電泳技術(shù)[10].最近，基于Cu2+[11-17]、Ni2+[18-22]、Zn2+[23]等可以和蛋白質(zhì)表面的組氨酸基團(tuán)進(jìn)行螯合的金屬親和蛋白吸附劑被廣泛用于去除或富集富含組氨酸的蛋白質(zhì).

海藻酸鈉(SA-Na)和羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)分子中均含有大量游離的羥基和羧基，通過陽離子交換使其具有吸附金屬離子的能力，可以對Cu2+進(jìn)行有效吸附[24].Ca2+的離子空間最適合與SA-Na形成穩(wěn)定的配合物.CMC-Na可以有效增強(qiáng)復(fù)合材料的強(qiáng)度.SA-Na和CMC-Na對Cu2+的固定不僅可以使Cu2+與蛋白質(zhì)表面的組氨酸殘基發(fā)生螯合作用，而且避免了Cu2+在中性條件下生成Cu(OH)2沉淀，失去與蛋白質(zhì)的配位作用，使復(fù)合材料起到對蛋白質(zhì)選擇性富集和分離的作用.

本論文基于去除復(fù)雜樣品中高豐度蛋白后，直接檢測小分子的思路，使用SA-Na和CMC-Na作為基質(zhì)，使用Ca2+為交聯(lián)劑，得到復(fù)合納米片SA-Ca/CMC-Ca，將Cu2+固定到材料表面，得到 SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+，用來富集富含組氨酸的蛋白質(zhì).通過該方法對高豐度蛋白進(jìn)行去除后，可以滿足血清中的核苷類物質(zhì)的直接色譜進(jìn)樣檢測.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

海藻酸鈉(SA-Na)，AR級，aladdin (北京)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，CP級，國藥集團(tuán) (上海)；無水氯化鈣(CaCl2)，純度96%，武漢市化學(xué)試劑廠(武漢)；尿素，AR級，科密歐 (天津)；五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)，純度不低于99.0%，西隴化工(成都)；牛血紅蛋白(BHb)、牛血清蛋白(BSA)和溶菌酶(LYZ)均購于北京拜爾迪生物科技公司(北京)；胞苷、胸苷、尿苷、肌苷均購于阿拉丁(上海)；超純水，Milli-Q系統(tǒng)(Millipore, Bedford, MA, USA).

傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜，Vertex70 (Bruker)；紫外可見分光光度計，TU-1810 (北京普析通用公司)；精密天平，NBL 214e型號(武漢艾德姆衡器有限公司)；真空干燥箱，DZF-6020 (上海一恒科技有限公司)；透射電子顯微鏡(TEM)，JEOL電子顯微鏡(美國波士頓)；掃描電子顯微鏡(SEM)，日立SU8010電子顯微鏡(日本)；恒溫振蕩器，國華SHA-C (常州國華電器有限公司)；冷凍離心機(jī)，湘儀H-2050R (長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司).

色譜分析在液相色譜(Dionex Ultimate 3000)上完成，全自動進(jìn)樣系統(tǒng)，色譜柱為反相C18柱(5 μm, 4.6×150 mm, Hedera ODS-2)，紫外檢測器(DAA-3000RS)進(jìn)行檢測.

1.2 材料制備

配制含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6%氫氧化鈉和4%尿素的水溶液97.0 g，將3.0 g SA-Na溶于其中，經(jīng)過充分?jǐn)嚢枋蛊湫纬赏该魅芤海玫劫|(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%的SA-Na溶液；同理將3.0 g CMC-Na溶于其中，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的CMC-Na溶液.

將上述兩種溶液按照SA-Na/CMC-Na的質(zhì)量比分別為7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7 的比例進(jìn)行混合，混合成總質(zhì)量為10.0 g的溶液.磁力攪拌均勻后，加入50.0 mL的3% CaCl2溶液進(jìn)行交聯(lián)，充分?jǐn)嚢?0 min后，抽濾并用超純水充分洗滌，材料放入60 ℃烘箱中干燥，干燥后對材料進(jìn)行研磨，即可得到SA-Ca/CMC-Ca復(fù)合材料.

稱取上述各種比例研磨好的SA-Na/CMC-Ca復(fù)合材料5份，每份50.0 mg，將其分別與5.0 mL不同濃度的硫酸銅溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)在磁力攪拌下反應(yīng)4.0 h，使材料嫁接上Cu2+，然后用超純水對材料進(jìn)行充分洗滌，去除材料表面物理吸附的Cu2+，洗凈后將材料放入60 ℃真空干燥箱烘干，研磨，即可得到SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+.

1.3 吸附試驗(yàn)

1.3.1 SA-Ca/CMC-Ca材料對Cu2+的吸附量

將吸附銅離子后的材料與硫酸銅溶液進(jìn)行分離，取上清液，使用紫外分光光度計605 nm下測定吸光度值，通過原始硫酸銅的吸光度與吸附銅離子后上清液的吸光度計算銅離子在材料上的吸附量，并與火焰原子吸收法測定結(jié)果進(jìn)行對照.

1.3.2 SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+材料對BHb、BSA、LYZ的吸附

準(zhǔn)確稱取2.0 mg SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+，分別加入到5.0 mL不同質(zhì)量濃度(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mg/mL)的BHb溶液中進(jìn)行吸附.每隔10 min高速離心后，取上清液稀釋，然后取500 μL與2.5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液顯色10 min，使用UV-Vis計在595 nm處測定吸光度值，并計算材料對BHb的吸附量.同樣，取2.00 mg材料對4.0 mg/mL的BSA蛋白溶液和1.0 mg/mL的LYZ蛋白溶液進(jìn)行吸附，操作同上.

1.3.3 SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+材料去除人血血清中蛋白質(zhì)

準(zhǔn)確稱取10.0 mg SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+，對稀釋10倍的1.0 mL人血血清中蛋白質(zhì)吸附10 min，離心取上清液后，另取10.0 mg材料對上清液再次吸附10 min，離心取上清液.將上清液稀釋后，取500 μL與2.5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液混合并顯色測定吸光度，計算出材料對血清中蛋白質(zhì)的去除率.

1.4 核苷檢測

1.4.1 pH對吸附的影響

10 mg材料吸附1.0 mL pH值分別為3.0～9.0的胸苷、肌苷、胞苷和尿苷混合液(2.0 μg/mL)，吸附20 min后進(jìn)行離心去除SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+，取上清液進(jìn)UPLC進(jìn)行檢測.核苷檢測使用的色譜梯度洗脫條件為：A，乙腈；B，12.5 mmol/L甲酸銨溶液；0～2.5 min，B：95%～86%；2.5～4 min，B:86%～30%；4～10 min，B：30%，流速：0.7 mL/min，紫外檢測波長：259 nm.

1.4.2 核苷檢測回收率的測定

分別使用0.1、0.5、1.0、3.0、5.0 μg/mL的胸苷、肌苷、胞苷和尿苷混合標(biāo)準(zhǔn)液做線性曲線.取100 μL血清，在血清中分別加入10 μg/mL的混合核苷標(biāo)準(zhǔn)樣品0、20、100、300 μL，稀釋至1.0 mL，配置成含有0、0.2、1.0、3.0 μg/mL混合核苷的血清樣品，分別使用10.0 mg材料對樣品吸附兩次，每次10 min，離心后取最終上清液進(jìn)液相進(jìn)行檢測，計算4種核苷在未加標(biāo)時的濃度以及加標(biāo)低、中、高3個濃度下的回收率.

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的合成與表征

圖1是材料制備和使用的示意圖，圖2分別為合成不同階段材料的紅外光譜圖.由圖2可以看出，SA-Na和CMC-Na的FT-IR譜圖中出現(xiàn)特征吸收峰C=O(1 680 cm-1)，-OH (3 400 cm-1)，-CH2(2 930 cm-1和1 460 cm-1)，在SA-Ca/CMC-Ca和SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+中同樣有這些特征吸收峰，證明了復(fù)合材料中同時包含海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉兩種材料.同時還發(fā)現(xiàn)，與其他3種材料比較，SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+在1 000 cm-1處C-O的吸收峰發(fā)生了紅移，證明了Cu2+與材料其中的羧基發(fā)生了配合作用.

圖1 樣品制備以及蛋白質(zhì)吸附和核苷檢測過程

圖2 (a) SA-Na, CMC-Na, SA-Ca/CMC-Ca, SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+的紅外光譜圖，(b) SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+材料表面Zeta電勢

由Zeta電勢結(jié)果可知， pH在4.0～9.0范圍內(nèi)，所合成的SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+材料的電勢均為負(fù)值，且隨著pH的逐漸增加，材料的表面電勢逐漸變負(fù)，在pH為7.0后趨于穩(wěn)定，說明Cu2+的加入對材料的負(fù)電性沒有影響，反而為材料提供了與蛋白質(zhì)配合的位點(diǎn).由于所研究的含組氨酸的BHb和BSA蛋白表面均帶正電荷，說明材料對蛋白質(zhì)的吸附除了Cu2+與咪唑基的配位作用以外，還有靜電作用.

從圖3的掃描電鏡(SEM)圖可以看出，材料在吸附Cu2+之后，顆粒更加分散，可能是由于在吸附Cu2+時劇烈攪拌的沖擊作用導(dǎo)致.這使得材料的比表面積增加，更多地吸附蛋白質(zhì).從圖3透射電鏡(TEM)圖可以看出SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+具有許多孔狀結(jié)構(gòu).BET測定結(jié)果表明材料的比表面積為16.507 9 m2/g.

圖3 SA-Ca/CMC-Ca (a, c) 和SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+ (b, d) 的SEM和TEM圖

圖4為不同比例SA-Na與CMC-Na合成的復(fù)合材料對Cu2+的吸附量的影響.從圖4可以看出，SA-Na與CMC-Na的質(zhì)量比對Cu2+的吸附量并沒有顯著性差異，所測得的材料對Cu2+的吸附量平均為0.55 g/g.為了進(jìn)一步得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，將各比例的材料混合均勻后，使用火焰原子吸收法對SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+上的Cu2+含量進(jìn)行測定，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37.20%，換算可得，Cu2+的吸附量為0.59 g/g，與紫外吸光法所測得的0.55 g/g的結(jié)果相近.

圖4 SA-Na/CMC-Na在不同比例下對Cu2+的吸附量

2.2 吸附模型

利用吸附模型對蛋白質(zhì)吸附行為進(jìn)行了探究.吸附動力學(xué)模型通常使用準(zhǔn)一級模型或準(zhǔn)二級模型進(jìn)行模擬.準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級模型代表影響吸附過程的不同限制因素.若擬合曲線更符合準(zhǔn)一級模型，即擬合曲線為直線，則表示限制因素主要為顆粒內(nèi)傳質(zhì)阻力.準(zhǔn)二級模型則認(rèn)為吸附機(jī)制是吸附過程的限制因素，兩者截然不同.

準(zhǔn)一級動力學(xué)方程：

lg(Qe-Qt)=lgQe-k1t

(1)

準(zhǔn)二級動力學(xué)方程：

(2)

其中，Qe和Qt分別表示平衡時吸附量和t時刻吸附量.k1和k2分別為準(zhǔn)一級吸附速率常數(shù)(min-1) 和準(zhǔn)二級吸附速率常數(shù)(g/mg h).

BHb表面裸露的組氨酸個數(shù)為14個，BSA表面裸露的組氨酸個數(shù)為4個，而LYZ表面沒有裸露的組氨酸，因此在理論上，SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對BHb這3種蛋白質(zhì)的吸附量應(yīng)該為BHb>BSA>LYZ.從圖5可以看出，SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對BHb的吸附在50 min的時候達(dá)到平衡，最大吸附量大約為33 g/g.對BSA的吸附在40 min時達(dá)到平衡，最大吸附量大約為9.8 g/g.而對LYZ的吸附量只有0.1 g/g左右.與理論上預(yù)測的吸附量順序一致.此外，沒有固定Cu2+的SA-Ca/CMC-Ca材料對BHb的吸附量與SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對LYZ的吸附量相同，說明SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對BHb優(yōu)越的吸附量主要是基于銅離子與組氨酸的相互作用，而由于LYZ表面不包含有裸露的組氨酸，且LYZ表面電荷帶有正電荷，因此，SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對其的吸附主要是基于非特異性吸附.

圖5 SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對BHb、BSA、LYZ的吸附曲線和SA-Ca/CMC-Ca對BHb的吸附曲線

為了驗(yàn)證 SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對BHb的吸附動力學(xué)行為，我們分別進(jìn)行了準(zhǔn)一級動力學(xué)模型以及準(zhǔn)二級動力學(xué)模型的擬合，結(jié)果如圖6所示，并且擬合所得的相關(guān)參數(shù)如表1所列.

圖6 SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對BHb吸附的(a)準(zhǔn)一級模型擬合曲線和(b)準(zhǔn)二級模型擬合曲線

從表1看出，準(zhǔn)一級模型的R2大于準(zhǔn)二級模型的R2值，因此材料對BHb的吸附更加符合準(zhǔn)一級動力模型.由于在試驗(yàn)過程中材料對蛋白質(zhì)的吸附量大，只能使用少量的材料完成試驗(yàn)，因此由線性曲線得到的理論吸附量與試驗(yàn)所得的吸附量存在較大的誤差.

表1 準(zhǔn)一級動力學(xué)模型、準(zhǔn)二級動力學(xué)模型相關(guān)參數(shù)值

與查閱到的文獻(xiàn)對比結(jié)果如表2所列.本試驗(yàn)制備的SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對BHb的吸附量最大，吸附達(dá)到平衡的時間較短，說明材料具有很好的吸附性能.

表2 與文獻(xiàn)中報道材料對BHb吸附量的比較

2.3 吸附等溫模型

我們計算了SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+材料對BHb的吸附等溫模型，并用Langmuir方程和Freundlich方程進(jìn)行擬合.

(1)Langmuir方程：

(3)

式中，Ce：平衡濃度(mg/L)；Qmax為材料的最大單層吸附量(mg/g)，KL為Langmuir吸附常數(shù)(L/mg).該模型認(rèn)為吸附行為為單分子層吸附模式[27].

(2)Freundlich方程

(4)

式中，Kf為Freundlich吸附常數(shù)(L/mg)；1/n：吸附指數(shù),可粗略地表示吸附強(qiáng)度隨著溫度提高，1/n趨1.Freundlich模型描述了表面不均一或表面吸附粒子后產(chǎn)生相互作用的表面吸附行為[28].

從圖7可以看出，在試驗(yàn)過程當(dāng)中，當(dāng)BHb的質(zhì)量濃度達(dá)到14 g/L時，材料已經(jīng)不能完全吸附BHb.SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對BHb的熱力學(xué)吸附行為結(jié)果如圖8所示，擬合所得的相關(guān)參數(shù)如表3所列.

圖7 SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+材料對BHb吸附的Qe-Ce圖

圖8 SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+材料對BHb吸附的 (a) Langmuir等溫吸附方程和 (b) Freundlich吸附等溫方程

從表3看出，F(xiàn)reundlich方程的R2值大于Langmuir方程的R2值.因此，SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對BHb的吸附更符合Freundlich等溫吸附模型，屬于多層吸附，基于上述對材料表面Zeta電勢的測定結(jié)果，所制備的材料不僅可以通過對含有組氨酸的蛋白進(jìn)行吸附，也可以通過靜電作用對酸性蛋白吸附，所以該吸附機(jī)理導(dǎo)致多層吸附的發(fā)生.同樣，因材料對BHb非常大的吸附量，造成了試驗(yàn)過程當(dāng)中的誤差也較大，因此所得到的理論數(shù)值與實(shí)際試驗(yàn)所得數(shù)值相差較大.

表3 Langmuir等溫吸附模型和Freundlich等溫吸附模型的相關(guān)參數(shù)值

2.4 材料對血清中蛋白的去除

利用10 mg SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對200 μL血清進(jìn)行吸附試驗(yàn).第一次吸附10 min可以去除血清中80%以上的蛋白質(zhì)，吸附20 min并且進(jìn)行第二次20 min的吸附后，血清中蛋白的去除率可達(dá)98%以上.我們也進(jìn)行了凝膠電泳驗(yàn)證，在經(jīng)過兩次吸附后，血清中蛋白的條帶消失.該材料可以實(shí)現(xiàn)對血清蛋白的高效去除，達(dá)到了液相色譜對樣品處理的要求，使血清直接進(jìn)樣成為可能.

2.5 核苷的檢測

基于上述合成材料對血清中蛋白質(zhì)的高效去除能力，將其應(yīng)用于蛋白樣品中4種小分子核苷(胞苷、尿苷、肌苷和胸苷)的檢測，核苷作為遺傳物質(zhì)的主要組成部分，參與許多重要的生命活動.圖9為該試驗(yàn)檢測的4種核苷的結(jié)構(gòu)圖，在對實(shí)際樣品進(jìn)行試驗(yàn)前，首先驗(yàn)證了該材料在不同條件下對核苷化合物的吸附.

圖9 4種核苷的結(jié)構(gòu)圖

圖10為5.0 mmol/L的PBS緩沖溶液(pH在3.0～9.0之間)中，4種核苷化合物被材料吸附前后的上清液的色譜圖.在不同pH條件下，材料對4種核苷吸附后所得的色譜峰面積與吸附前相近，說明材料在該pH范圍對4種核苷化合物沒有吸附作用，可以用于蛋白樣品中對蛋白質(zhì)的吸附去除.

圖10 不同pH條件下四種核苷被SA-Ca/CMC-Ca@ Cu2+吸附前后上清液的色譜圖

基于人體生理pH條件為7.4，因此我們在pH為7.0的條件下，檢測實(shí)際血樣中4種核苷，并對樣品中4種核苷進(jìn)行加標(biāo)回收率測定，結(jié)果如圖11所示、表4所列.由圖11及表4可以看出，在空白血清樣品中含有少量胞苷、尿苷和肌苷，而胸苷未檢出.加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果顯示，胞苷、尿苷和胸苷的回收率較為穩(wěn)定，均在100%左右，而肌苷的回收率較低.從圖9可以看出，肌苷結(jié)構(gòu)中N元素量較高，與Cu2+之間產(chǎn)生配位作用的可能性較大，因此可能會在蛋白質(zhì)吸附過程中，部分肌苷隨著材料對蛋白質(zhì)的吸附而被包埋，隨著材料的吸附被一同被離心除去.

圖11 SA-Ca/CMC-Ca@Cu2+對4種核苷加標(biāo)樣品處理前后的 (a) 液相譜圖及 (b) 回收率

表4 實(shí)際血清樣品中4種核苷的質(zhì)量濃度

基于此，所制備的材料可以用于色譜檢測中高蛋白樣品中蛋白質(zhì)的去除，進(jìn)而對與Cu2+無相互作用的小分子化合物進(jìn)行檢測.

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用了海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉對Cu2+的吸附作用，制備了一種低成本的金屬親和吸附劑，進(jìn)一步利用Cu2+與組氨酸的配位作用對表面具有裸露組氨酸的蛋白質(zhì)如BHb、BSA進(jìn)行吸附與去除.在實(shí)際樣品血清中，對蛋白的去除率可以達(dá)到98%以上，滿足液相色譜檢測過程中對樣品處理的要求.該材料可以用于蛋白樣品中蛋白質(zhì)的去除而不影響小分子化合物的測定，有望成為色譜檢測過程中，對高蛋白樣品中小分子測定的前處理方法.