賈 星

(中國科學(xué)院 生物物理研究所，北京 100101)

聚焦離子束(FIB)技術(shù)利用高強度離子束(通常是鎵離子)對材料進行納米加工，目前已廣泛應(yīng)用于材料科學(xué)領(lǐng)域，其原理是離子束與試樣表面原子之間碰撞將樣品表面原子濺射出來從而達到切割的效果.近些年發(fā)展起來的利用冷凍聚焦離子束減薄技術(shù)(Cryo-FIB)制備冷凍含水切片已適用于冷凍透射電鏡電子斷層三維成像(Cryo-ET)高分辨率數(shù)據(jù)采集.Cryo-FIB可將厚的細胞、組織樣品減薄至適合透射電鏡成像的薄片(通常200～300 nm)來進行觀察.這種利用Cryo-FIB進行切割減薄的方法避免了傳統(tǒng)切片機冷凍切片技術(shù)產(chǎn)生的壓縮、褶皺等假象的困擾，而且技術(shù)難度相對較低，制樣的重復(fù)性和成功率大大提高.利用快速和高壓冷凍技術(shù)保存的細胞內(nèi)大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息可以通過Cryo-FIB減薄技術(shù)很好地呈現(xiàn)出來，為進一步高分辨率鑒定及結(jié)構(gòu)解析提供更高的可信度.同時，這些結(jié)構(gòu)存在于完整的細胞中，從而使Cryo-ET獲得了原位接近生理狀態(tài)的結(jié)構(gòu)信息，不僅能夠揭示大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和它們在細胞內(nèi)的位置，而且能夠捕捉其不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)動態(tài).

近日來，發(fā)表在Nature Protocols雜志上的一篇文章詳細介紹了利用Cryo-FIB 減薄細胞制備冷凍含水切片的試驗步驟[1].該試驗流程主要包括以下幾個步驟：首先在電鏡載網(wǎng)上進行細胞培養(yǎng)，或者直接將培養(yǎng)的細胞滴到電鏡載網(wǎng)上，之后進行快速冷凍，接著將載網(wǎng)卡環(huán)后進行冷凍光鏡觀察確定切割位置，接著進行Cryo-FIB減薄，然后放到冷凍透射電鏡中進行冷凍電子斷層掃描成像，最后進行三維重構(gòu)或其他分析.

除了詳細的試驗步驟，該文章還介紹了試驗中的一些小技巧，其中需要注意的5個要點：(1)在使用Vitrobot儀器進行快速冷凍時，吸水濾紙要放在載網(wǎng)細胞的反面，正面則使用一張含氟聚合物薄膜(Aclar sheet)，這樣避免了擠壓吸水過程中細胞可能被濾紙粘走的狀況.當然Leica公司的快速冷凍儀(型號EM GP)所設(shè)計的單面吸水更適用于該試驗.(2)在Autogrid卡環(huán)后為了便于辨認其在掃描電鏡和透射電鏡上的切片方向，在卡環(huán)前就用marker筆在卡環(huán)的背面一端標記紅色為掃描電鏡上樣方向，在距此90 °的側(cè)面做黑色標記為透射電鏡上樣方向.(3)雙束掃描電鏡的離子槍和電子槍之間的夾角是52 °，在進行切割減薄時，離子槍與載網(wǎng)平面之間需要具有一定夾角，一般為8～15 °，二者之間夾角越小則得到的細胞切片面積就會越大一些.由于不同儀器配備的樣品座的預(yù)傾角度不一樣，因此在用離子束切割前樣品臺的傾轉(zhuǎn)角度需要根據(jù)實際情況確定.(4)進行冷凍聚焦離子束減薄前需要在腔室內(nèi)對樣品沉積一層Pt進行保護，Pt沉積的厚度需要從氣體注入系統(tǒng)(GIS)的溫度、樣品臺位置和沉積時間等三個方面進行調(diào)整.Pt沉積后還需要進行Cryo-FIB成像，通過離子束照射釋放有機Pt中的揮發(fā)成分，使Pt附著在樣品表面.(5)由于試驗過程中樣品要在電鏡腔室內(nèi)放置幾個小時，最先切好的切片表面可能沉積了一些污染，所以在下樣前還需要用Cryo-FIB小束流(10～30 pA)對所有切片進行短暫的表面清理.最后文章總結(jié)了目前Cryo-FIB技術(shù)中出現(xiàn)的質(zhì)量問題，例如載網(wǎng)破損產(chǎn)生的裂縫或者孔洞、Cryo-FIB切割過程中產(chǎn)生的窗簾效應(yīng)、切片中的結(jié)晶、切片表面的冰污染、由于切片升溫產(chǎn)生的豹斑狀冰污染和切片上不均勻的厚度等.

針對Cryo-FIB中遇到的諸多瓶頸問題，本文從樣品自身方面(如何將細胞鋪在載網(wǎng)網(wǎng)眼中央，如何在光電關(guān)聯(lián)后進行快速原位冷凍)、切割過程(如何實現(xiàn)自動化切割并提高成功率)以及切片質(zhì)量(如何減小切片厚度，如何減少污染，如何控制精修的成功率)三個方面進行文獻調(diào)研(如圖1所示)，總結(jié)了近期相關(guān)文獻中的解決之道.

圖1 Cryo-FIB各種瓶頸問題匯總

利用Cryo-FIB減薄細胞，首先要有一個細胞位置和冰層厚度都合適的樣品.試驗人員經(jīng)常遇到的問題就是細胞沒有粘附在網(wǎng)眼中央而是在載網(wǎng)網(wǎng)格的框架上，或者一個網(wǎng)眼里團聚了多個細胞導(dǎo)致凍出的樣品冰層很厚.Leeya[2]等提出了對細胞外基質(zhì)進行“微圖案化來”控制細胞形態(tài)這一技術(shù).此技術(shù)主要用于力學(xué)生物學(xué)研究，例如細胞間作用力、細胞與胞外基質(zhì)間的應(yīng)力能量狀態(tài)和細胞內(nèi)牽引應(yīng)力分布等.Toro-Nahuelpan[3]等提出將這一技術(shù)應(yīng)用于Cryo-FIB減薄細胞.文章論述了對電鏡載網(wǎng)進行無掩模的光照圖案化，試驗流程如下：首先在電鏡載網(wǎng)上鋪一層多孔碳膜，其次在多孔碳膜上包裹一層防污涂層阻礙蛋白質(zhì)粘附，接著加入光引發(fā)劑，用紫外光將微圖案投射到網(wǎng)眼中央，防污涂層被降解蝕刻出微圖案，然后加入粘附蛋白使其附著在蝕刻出的微圖案上，最后鋪上細胞，細胞即可粘附在蛋白上.對比細胞在未處理的載網(wǎng)和利用無掩模光照圖案法處理過的載網(wǎng)上的分布，可見傳統(tǒng)電鏡網(wǎng)格中大多數(shù)細胞都粘附在網(wǎng)格的框架上.在未處理的載網(wǎng)上，細胞隨機分布，只有少數(shù)細胞分布在網(wǎng)格靠近中間的位置，需要人為尋找定位.而經(jīng)過處理的載網(wǎng)，即在金網(wǎng)網(wǎng)格的網(wǎng)眼中央加上一個直徑20 μm的纖維連接蛋白組成的微圖案，可見所有細胞都定位在網(wǎng)眼的正中央.這樣就大大增加了Cryo-FIB切割前細胞的可選數(shù)量，并且細胞位置可控.

光電關(guān)聯(lián)為FIB的精準切割打開了一扇窗口，但是有些生物學(xué)的動態(tài)過程快于將樣品從光鏡轉(zhuǎn)移到快速冷凍儀上的時間，F(xiàn)uest[4]等提出了“原位微流控冷凍固定-CryoFIB-CryoET”整套試驗流程.該試驗設(shè)計了一個搭載在光鏡上的微流控樣品臺裝置，進行活細胞成像后直接在光鏡下以毫秒級別進行冷凍固定，可以捕捉到細胞內(nèi)高度動態(tài)性的活動，例如胞內(nèi)運輸、膜轉(zhuǎn)運、細胞分裂、免疫細胞激活等過程.之后將樣品取下并在液氮中轉(zhuǎn)移到Cryo-FIB中進行原位定點切割，利用Cryo-FIB lift-out技術(shù)進行樣品減薄制備冷凍含水切片，之后轉(zhuǎn)移到透射電鏡下進行數(shù)據(jù)收集.該文章的初步結(jié)果預(yù)示了將毫秒級的原位微流控冷凍固定與分子空間分辨率的Cryo-ET相聯(lián)系來研究四維空間的生物學(xué)過程的大好發(fā)展前景.

在利用Cryo-FIB進行減薄細胞的過程中，大部分步驟都需要人工調(diào)節(jié).人工操作費時費力，且切割質(zhì)量和成功率取決于人員的熟練程度，通常僅白天工作，只能產(chǎn)出5～10片.人工操作需要每5～15 min執(zhí)行一系列重復(fù)操作，例如確認樣品位置、確認切割位置、逐步更改FIB切割束流、時刻注意樣品是否有漂移、確認最后精修的切片位置等,過程繁瑣,需要投入大量時間，而又低通量.

目前，有文獻報道利用Cryo-FIB將細胞減薄過程自動化.Buckley[5]等發(fā)表題為“高通量原位結(jié)構(gòu)生物學(xué)的自動化冷凍切片制備”的文章，該試驗是在配備了Leica冷臺和VCT500 冷凍傳輸系統(tǒng)的Helios Ux G4 DualBeamTM儀器上進行.作者首先通過人工操作選擇一系列切割目標的位置、做標記、設(shè)定切割參數(shù)，然后通過運行所寫的“autolamella”程序的腳本達到自動切割所有目標的位置.文中提到使用該流程可每小時完成5個切片.作者分別測試了3種樣品，成功率分別為：酵母97%，動物細胞84%，微晶56%.其中酵母和動物細胞切片失敗的主要原因是窗簾效應(yīng)或切片破損.而微晶樣品成功率低下的主要原因是該特定樣品的不均一性，導(dǎo)致在精修的時候切片很容易彎曲進而失敗.

Zachs[6]等提出了一套全自動循序切割方案.該試驗是在配備了Leica VCT500 冷凍傳輸系統(tǒng)的Zeiss Crossbeam 550 FIB-SEM儀器上使用SmartFIB軟件進行操作.首先對FIB的各個束流進行alignment，并拍一張載網(wǎng)全貌，儲存初始坐標，再進行backlash correction，從而保存目標的最終坐標位置.然后設(shè)置一系列的粗切和精修參數(shù)，為了提高定位的精準性，在目標物附近引入了漂移矯正，這個過程大概每個細胞花費9 min.接下來是自動切割過程，首先是定位目標，接著做backlash correction和drift correction，然后是一系列的粗切參數(shù)設(shè)置和粗切過程.最后是精修過程，首先要進行切片的再定位，并做backlash correction和drift correction，之后將切片精修到300 nm.作者提到該試驗流程能達到98%的粗切成功率和95%的精修成功率.使用該流程可以在一個載網(wǎng)上切20個酵母細胞的切片.在精修的過程中，微小的漂移會導(dǎo)致得到的切片厚度在155～379 nm不等.在透射電鏡下，作者在測試的酵母細胞切片中觀察到了細胞核、核孔復(fù)合物、細胞核內(nèi)的微管以及原纖維、細胞質(zhì)中的核糖體、囊泡、線粒體等結(jié)構(gòu).作者還測試了藍藻細胞，觀察到了類囊體膜、藻膽蛋白體、間隙連接.在多細胞藍藻菌中，細胞之間的隔膜包含一個肽聚糖盤和兩層細胞質(zhì)膜.間隙連接呈管狀橫貫營養(yǎng)細胞間隙，包含管、塞和帽等3個模塊.三維重構(gòu)后得到的間隙連接的精細結(jié)構(gòu)分辨率和前人發(fā)表的利用人工操作Cryo-FIB切割得到的結(jié)構(gòu)的分辨率相當.該文章提出的試驗流程大大縮短了人工和機器的投入時間，例如切16個切片之前需要10 h的人工投入，而現(xiàn)在只需要2.4 h.之前一個切片需要38 min的儀器運行時間,現(xiàn)在也可縮短到25.5 min.

Sebastian[7]等報道了一種Cryo-FIB自動切割的高效化試驗流程.該文章不僅提出了一個新的自動化軟件切割方案，而且還針對切片質(zhì)量中的厚度及冰污染問題提出了解決方案.切片上的冰污染主要有兩個來源：實驗室濕度環(huán)境和SEM-FIB腔室環(huán)境.為解決實驗室濕度環(huán)境造成的冰污染，作者所在實驗室設(shè)計了一個干燥的上樣系統(tǒng)，包括一個手套箱、一個通用的樣品準備臺(包含autoloader卡環(huán)裝置、Cryo-FIB傳輸上樣臺、autoloader cassette裝置)和一個高真空的冷凍傳輸系統(tǒng).其中手套箱內(nèi)的濕度能夠控制在1%以下，樣品準備臺可以在沒有冰污染的情況下保持冷凍溫度數(shù)小時.SEM-FIB腔室環(huán)境污染主要包括已切割樣品碎屑的沉積以及腔室內(nèi)水氣沉積.其中已切割樣品碎屑的沉積可以通過先統(tǒng)一粗切再統(tǒng)一精修來解決.腔室內(nèi)水氣沉積主要由腔室內(nèi)環(huán)境中的水氣沉積速率和升華速率之間的動態(tài)關(guān)系決定，作者設(shè)計了一個大面積的Cryo-shield和一個可以擋在樣品上方的Cryo-shutter來減小樣品附近的水氣分壓，從而減少水氣在樣品上的沉積.由于樣品表面溫度決定水氣升華速率，因此作者在樣品臺上設(shè)置了一個可加熱的設(shè)備使樣品溫度維持在-165 ℃.這3個硬件的改造使水氣沉積的污染速率從72 nm/h降到了5 nm/h，因此將得到的切片在進行三維重構(gòu)后可以明顯看到樣品表面的沉積厚度大大減少.另外，作者基于AutoTEM Cryo software applications這一軟件在Aquilos cryo-FIB/SEM儀器上進行自動化切割，其中還加入了接下來要介紹的為了防止切片彎曲而引入的“微型膨脹接頭”方法.該自動化切割流程的成功率能夠達到88%.

Cryo-FIB切片在進行精修的過程中常常會產(chǎn)生彎曲，這通常是由于冷凍后的碳膜和載網(wǎng)的熱膨脹系數(shù)不同而使碳膜皺縮導(dǎo)致.Wolff[8]等提出了一種微型膨脹接頭方案.該想法源于建筑工程學(xué)，例如水泥地板的施工，其中的縫隙可以提供物理緩沖.在細胞兩側(cè)分別切兩條1 μm寬的縫隙，可以使78%的切片厚度保持在200 nm.如果不進行這一操作，切片成功率只有23%.該方案的缺點在于在進行數(shù)據(jù)收集的時候會產(chǎn)生beam-induced motion.作者認為這一缺憾可以通過增加輸出照片幀數(shù)，并刪除起始幾張照片來彌補.

綜上，本文就最近發(fā)表的利用Cryo-FIB制備冷凍含水切片技術(shù)問題的一些文章進行了總結(jié)和討論，針對樣品準備、高通量自動化切割、切片質(zhì)量保障等方面提出了相關(guān)解決方案，以提高利用Cryo-FIB技術(shù)制備冷凍含水切片的成功率和通量.除此之外，利用冷凍聚焦離子束減薄生物樣品還有一些容易凸顯的問題，比如切片上出現(xiàn)的豎條紋，稱為“窗簾效應(yīng)”.對于常溫的材料樣品，其形成與聚焦離子束切割固有的傾斜側(cè)壁密切相關(guān)，當樣品有表面形貌起伏或成分差異時，會產(chǎn)生切割速率的不同，就會形成窗簾效應(yīng).解決辦法通常是在樣品表面用FIB誘導(dǎo)輔助沉積Pt保護層，使樣品表面變得平坦，也可以通過改變樣品位置，從表面沒有起伏的面開始切割，從而避開其影響.對于冷凍的生物樣品，只能通過Pt沉積進行保護，而冷凍條件下Pt沉積是通過冷凍吸附實現(xiàn)，并且氣體噴出的量較少(約幾秒鐘)，隨著切片不斷被減薄，前端Pt層也越來越短，當Pt被切掉后離子束再切割就會對切片前端產(chǎn)生損傷使切片變短，并伴隨窗簾效應(yīng).如要得到平整且薄的切片，就要求試驗者在精修的過程中有豐富的經(jīng)驗和切割手法來保證切片的前端一直有Pt保護層.所謂“魔高一尺，道高一丈”，辦法總比困難多，Cryo-FIB技術(shù)發(fā)展也是日新月異，如何將好的技術(shù)方案應(yīng)用于自己的試驗當中，需要每個試驗者思考.

致謝：

由衷感謝中國科學(xué)院生物物理研究所蛋白質(zhì)科學(xué)研究平臺生物成像中心孫飛研究員、季剛正高級工程師在本文撰寫過程中給予的指導(dǎo)建議.