向莉偉，鄭華川

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗?zāi)[瘤學(xué)實驗室2，遼寧 本溪 117004）

卵巢癌的發(fā)病率居婦科惡性腫瘤第3位，病死率居首位。卵巢癌起病隱匿，缺乏早期的典型癥狀和成熟的早期診斷方法，且易于盆腹腔廣泛種植播散，80%～85%患者還會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為35%～38%［1］。因此，提高對卵巢癌發(fā)生過程中基因表達(dá)變化的認(rèn)識，識別新的癌癥診斷生物標(biāo)志物和新的治療靶點，明確相關(guān)分子機制，可能有助于提高診斷、治療和預(yù)防水平。再生基因（regenerating gene，REG） 家族屬于鈣依賴性凝集素超家族，這些蛋白在功能上類似于凝集素，具有抗凋亡因子作用，REG基因編碼分泌蛋白，在糖尿病、炎癥損傷自身免疫和癌瘤發(fā)生中起重要作用［2］。隨著對癌癥發(fā)生、發(fā)展及其機制研究的不斷深入，已有文獻(xiàn)報道再生基因4（regenerating gene family member 4，REG4）在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，對腫瘤的發(fā)展、治療和預(yù)后產(chǎn)生重要影響，但關(guān)于卵巢癌中REG4的表達(dá)及其分子機制少見報道。本研究旨在觀察REG4在卵巢癌中的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNA3.1-REG4表達(dá)質(zhì)粒由日本東北大學(xué)再生先進(jìn)生物科學(xué)系SUGAWARA教授提供；卵巢癌SKOV3細(xì)胞系購自美國ATCC公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；實時PCR、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、反轉(zhuǎn)錄酶、隨機引物購自日本TaKaRa公司；REG4抗體購自美國R&D公司；FITC/PI試劑盒購自中國凱基公司；Transwell小室購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 基因表達(dá)分析:UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫集合了包括癌癥基因組圖譜 （The Cancer Genome Atlas，TCGA）、國際腫瘤基因組協(xié)作組 （International Cancer Genome Consortium，ICGC）、基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫 （Genotype-Tissue Expression，GTEx）、癌細(xì)胞系百科全書 （Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE） 等在內(nèi)大約 200個公共數(shù)據(jù)集，進(jìn)入UCSC Xena （http://xena.ucsc.edu） 網(wǎng)頁調(diào)取TCGA、TARGET、GTEx數(shù)據(jù)庫，選擇sample type和ovary，輸入REG4，選擇Gene Expression，對REG4在卵巢的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析。調(diào)取TCGA數(shù)據(jù)庫，選擇sample type和ovary，再選擇REG4和感興趣的基因，分析REG4與該基因在mRNA表達(dá)水平上的關(guān)系。

1.2.2 生存分析:使用Kaplan-Meier Plotter （http://www.kmplot.com） 評估REG4mRNA表達(dá)對卵巢癌預(yù)后的影響。Kaplan-Meier Plotter分析各亞型卵巢癌患者的總體生存率、無進(jìn)展生存率和后進(jìn)展生存率與REG4mRNA表達(dá)的關(guān)系。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒鑒定:卵巢癌SKOV3細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞接種于6 cm2培養(yǎng)盤，待融合度達(dá)60%左右，PBS沖洗1次，加入200 μL無血清培養(yǎng)基。將2.4 μg質(zhì)粒和9 μL轉(zhuǎn)染試劑分別加入到200 μL無血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育15 min后加入到培養(yǎng)盤中，500 mg/L遺傳霉素 （geneticin，G418）篩選單克隆細(xì)胞株，實時PCR、Western blotting檢測REG4表達(dá)水平，取REG4高表達(dá)單克隆細(xì)胞株用于后續(xù)實驗。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-REG4的細(xì)胞株作為過表達(dá)REG4組，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細(xì)胞作為Mock組。

1.2.4 實時PCR檢測:取2組對數(shù)生長期細(xì)胞，根據(jù)QIAGEN RNase minikit 說明書提取總RNA，使用禽骨髓母細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物對總RNA進(jìn)行cDNA合成。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書配制體系進(jìn)行實時PCR反應(yīng)。REG4基因擴增引物:上游5’-TAACTTGGAGCAGCAACGAATG-3’，下游5’-GGCTAGCAGAAAGGAAGAGGA-3’；內(nèi)參GAPDH引物:上游5’-CAATGACCCCTTCATTGAC C-3’，下游 5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。反應(yīng)條件:94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共34個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blotting:用RIPA裂解液中提取卵巢癌和轉(zhuǎn)染細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度。按濃度稀釋后95 ℃ 5 min變性。變性蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入2 mL抗REG4抗體 （美國R&D公司），4 ℃反應(yīng)過夜。二抗采用HRP標(biāo)記的羊抗兔的IgG，室溫反應(yīng)1 h，ECL-Plus試劑盒發(fā)光顯影檢測目的蛋白。

1.2.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力:將細(xì)胞接種于96孔板 （2×103/孔），每組設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)3個空白對照孔，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別在0、24、48 h加入20 μL MTT溶液，孵育4 h后棄掉液體，并每孔加入150 μL DMSO溶解，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測定各組490 nm處吸光度值并計算增殖率，以時間為橫軸、增殖率為縱軸繪制上漲曲線。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測:取處于對數(shù)生長期的2組細(xì)胞，收集細(xì)胞和上清液，PBS 沖洗2次，用Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液重懸至單細(xì)胞懸液，并調(diào)整其濃度為1×106/mL。加入5 μL Annexin V-FITC染料，室溫避光孵育15 min，再加入5 μL碘化丙啶染料孵育5 min，上流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.8 Transwell細(xì)胞侵襲實驗:取處于對數(shù)生長期的2組細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105/mL后接種于預(yù)先涂有基質(zhì)膠的Transwell小室上層，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘物。24 h后用棉球擦掉上層未遷移的細(xì)胞，PBS清洗小室，黏附在下層膜的細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫溶液染色，光學(xué)顯微鏡下 （×100）選取5個隨機區(qū)域照相。

1.2.9 基因富集分析:從 TCGA公共數(shù)據(jù)庫收集卵巢癌、REG4基因數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因集富集分析，探討REG4在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。滿足正態(tài)性檢驗的計量資料以表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。不滿足正態(tài)分布者以M（P25～P75） 表示，多組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。2組獨立樣本比較采用獨立樣本t檢驗，結(jié)果用3次獨立實驗的表示。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)分析

2.1.1REG4在卵巢癌組織中的表達(dá):收集515例樣本，其中正常卵巢組織88例，原位卵巢癌419例，復(fù)發(fā)性卵巢癌8例，分析REG4的表達(dá)。與正常卵巢組織相比 （均值=0），REG4mRNA表達(dá)水平在卵巢癌中上調(diào) （均值=1.56），在復(fù)發(fā)性卵巢癌中更高 （均值=2.35）（P＜ 0.001）。見圖1。

圖1 REG4在卵巢癌組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of REG4 in ovarian cancer tissues

2.1.2REG4相關(guān)基因表達(dá):REG4的表達(dá)與Bid（r=-0.203，P＜ 0.001）、Fas（r=-0.171，P＜ 0.001）、AIF1（r=-0.272，P＜ 0.001） 等凋亡因子的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，而與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK4（r=0.205，P＜ 0.001）、抑凋亡因子Bcl-2（r=0.204，P＜ 0.001）、促增殖因子Raf（r=0.118，P=0.039） 和藥物代謝相關(guān)酶ALDH1A1（r=0.121，P=0.036）、GSTA1（r=0.175，P=0.002）、GSTA2（r=0.201，P＜ 0.001）、UGT2A3（r=0.192，P＜ 0.001） 的表達(dá)呈正相關(guān)。

2.2 REG4 mRNA表達(dá)與卵巢癌患者生存率的關(guān)系

2.2.1REG4mRNA表達(dá)與所有卵巢癌患者生存率的關(guān)系:Kaplan-Meier Plotter分析結(jié)果顯示，REG4mRNA的高表達(dá)與所有卵巢癌患者的總體生存率、無進(jìn)展生存率和后進(jìn)展生存率降低相關(guān)，見圖2。

圖2 Kaplan-Meier曲線分析REG4 mRNA表達(dá)與卵巢癌患者總體生存率、無進(jìn)展生存率和后進(jìn)展生存率的關(guān)系Fig.2 The correlation between REG4 expression and overall，progression-free，and post-progression survival rates of the ovarian cancer patients according to Kaplan-Meier curve

2.2.2REG4mRNA表達(dá)與亞組卵巢癌患者生存時間的關(guān)系:組織學(xué)分型漿液性卵巢癌、臨床分期Ⅰ～Ⅳ期和病理分級Ⅱ～Ⅲ級的卵巢癌患者的總體生存率與REG4mRNA的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；組織學(xué)分型漿液性卵巢癌，臨床分期Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ期和病理分級Ⅲ級的卵巢癌患者的無進(jìn)展生存率與REG4mRNA的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；臨床分期Ⅲ期、病理分級Ⅱ級的卵巢癌患者的后進(jìn)展生存率與REG4mRNA的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；其余亞組的卵巢癌患者的總體生存率、無進(jìn)展生存率和后進(jìn)展生存率與REG4mRNA的表達(dá)量均不相關(guān)。見表1。

2.3 過表達(dá)REG4的SKOV3細(xì)胞表型

表1 Kaplan-Meier Plotter檢測REG4 mRNA對卵巢癌預(yù)后的影響Tab.1 The prognostic significance of REG4 mRNA in ovarian cancer estimated using Kaplan-Meier Plotter

通過G418篩選，成功獲得了穩(wěn)定高表達(dá)REG4的單克隆細(xì)胞株SKOV3。實時PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)REG4組細(xì)胞REG4mRNA的表達(dá)水平明顯高于Mock組 （P＜ 0.001），Western blotting結(jié)果表明，REG4組細(xì)胞REG4蛋白的表達(dá)水平明顯高于Mock組 （P＜0.05），表明其已穩(wěn)定高表達(dá)REG4。見圖3A。

MTT結(jié)果顯示，過表達(dá)REG4的SKOV3增殖能力明顯高于Mock組 （P＜ 0.05），表明REG4過表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖能力。見圖3B。

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，REG4過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞SKOV3凋亡減少 （P＜ 0.05），表明過表達(dá)REG4可抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的凋亡。見圖3C。

Transwell結(jié)果顯示，過表達(dá)REG4的SKOV3穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯高于Mock組 （P＜ 0.05），表明REG4過表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的侵襲能力。見圖3D。

2.4 基因富集分析

REG4在凋亡和藥物代謝細(xì)胞色素P450相關(guān)基因中富集。且REG4與凋亡相關(guān)基因呈明顯負(fù)相關(guān)，而與藥物代謝細(xì)胞色素P450相關(guān)基因呈正相關(guān)。見圖4。

3 討論

人REG4基因定位于染色體1q12-q21，編碼158個核苷酸，蛋白分子量為17 000［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，REG4mRNA在卵巢癌組織中表達(dá)升高，在胃癌、結(jié)直腸癌、大腸癌、胰腺導(dǎo)管腺癌等多種人類惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)REG4mRNA和蛋白表達(dá)升高［3-4］，提示REG4表達(dá)上調(diào)參與人類惡性腫瘤的發(fā)生。人卵巢癌細(xì)胞SKOV3過表達(dá)REG4蛋白后，細(xì)胞增殖增強，凋亡抑制。BISHNUPURI等［5］發(fā)現(xiàn)，REG4蛋白激活A(yù)kt/GSK3β/β-Catenin/TCF-4和EGF受體/Akt/AP-1信號通路，增加細(xì)胞周期調(diào)控基因Cyclin D1和Cyclin D3以及相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶 （CDK4和CDK6）的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。生物信息分析發(fā)現(xiàn)，REG4與周期蛋白依賴性激酶CDK4的表達(dá)呈正相關(guān)，同時基因富集結(jié)果顯示，REG4相關(guān)基因抑制凋亡信號通路，且REG4的表達(dá)與Bid、Fas、AIF1等凋亡因子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)。BISHNUPURI等［5］的研究也證明了REG4處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后，Bcl-2、Bcl-XL和Survivin蛋白表達(dá)增加，表明REG4能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡參與腫瘤發(fā)生。

圖3 REG4過表達(dá)對卵巢癌惡性細(xì)胞表型的影響Fig.3 The effects of REG4 overexpression on the aggressive phenotypes of ovarian cancer cells

圖4 依據(jù)KEGG的REG4表達(dá)相關(guān)基因富集的信號傳導(dǎo)通路分析Fig.4 Signal pathway analysis of REG4-related genes according to KEGG

卵巢癌患者的生存與卵巢癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。生存分析顯示，亞臨床分型和分級的卵巢癌中，REG4表達(dá)水平與患者生存率呈負(fù)相關(guān)。OUE等［6］發(fā)現(xiàn)，大腸癌中REG4的表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)，Ⅲ/Ⅳ期大腸癌中REG4表達(dá)頻率高于Ⅰ/Ⅱ期，且直腸癌與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。SAUKKONEN等［7］發(fā)現(xiàn)，胰腺導(dǎo)管腺癌中REG4的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級有關(guān)，且在腫瘤ⅠA～ⅡA期中，REG4血清水平高的患者生存期較差。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)REG4的卵巢癌細(xì)胞侵襲增強。HE等［8］發(fā)現(xiàn)，REG4蛋白能誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶7和基質(zhì)金屬蛋白酶9兩種細(xì)胞侵襲因子表達(dá)上調(diào)。此外，本研究中REG4高表達(dá)的卵巢癌患者的總體生存率、無進(jìn)展生存率和后進(jìn)展生存率較低，且復(fù)發(fā)性卵巢癌患者REG4的表達(dá)高于原發(fā)性卵巢癌患者。以上數(shù)據(jù)表明，REG4可能參與卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，并因此降低卵巢癌患者的生存率。

本研究中，REG4相關(guān)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，REG4與ALDH1A1、GSTA1、GSTA2、UGT2A3等藥物代謝相關(guān)酶的表達(dá)呈正相關(guān)，基因富集分析顯示，REG4與藥物代謝細(xì)胞色素P450相關(guān)基因密切相關(guān)。JIN等［9-10］發(fā)現(xiàn)，REG4蛋白能夠調(diào)控 Hsp27、Bcl-2的表達(dá)以及多種酪氨酸激酶受體等關(guān)鍵信號分子的激活，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受作用?？傊琑EG4不利于腫瘤的藥物治療。

綜上所述，REG4能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程、增殖和侵襲，抵抗凋亡，并能夠提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受水平，與卵巢癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為卵巢癌早期診斷、預(yù)后評價和晚期基因治療一個新的分子靶點，以提高卵巢癌患者生存率和生存質(zhì)量。